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Transcript

INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht - Karls - Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Diplom-Ingenieur (FH) Ramon Lopez Perez
aus Heidelberg
Tag der mündlichen Prüfung: 22. April 2015
T h e m a
Doppelstrangbruch-Induktion und DNA-Schadensantwort nach
12C-Ionen- und Photonenstrahlung in U87 Glioblastomzellen
Gutachter: Prof. Dr. Dr. Christoph Cremer
Prof. Dr. Dr. Peter Huber
ZUSAMMENFASSUNG
Schwerionenstrahlung entfaltet bei gleicher physikalischer Dosis eine höhere biologische
Wirksamkeit als Photonenstrahlung. In dieser Arbeit wurden die Ursachen dafür anhand der
DNA-Schadensantwort in U87 Glioblastomzellen untersucht. Ausschlaggebend sind hierbei
DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), deren Induktion und Reparatur durch Messung des DSBMarkers γH2AX (phosphoryliertes Histon H2AX) im Kontext des Zellzyklus verfolgt wurde. Weiter wurde untersucht, ob es strahlenspezifische Unterschiede in der Wahl des DSBReparaturmechanismus gibt, und welche Folgen beim Scheitern der Reparatur eintreten. Die
Untersuchungen ergaben, dass 12C-Ionen-Strahlung schwerer zu reparierende DSBs erzeugt
als Photonenstrahlung, die etwas verzögert und langsamer repariert werden. Dies bewirkte stärker ausgeprägte und länger anhaltende Zellzyklusblockaden, vorwiegend am G2/MÜbergang, sowie eine höhere Apoptoserate bei 12C-Ionen-Strahlung. Autophagozytose als
alternativer Weg des programmierten Zelltods spielte bei beiden Strahlenarten keine Rolle.
Die Wirkung der 12C-Ionen hing weniger stark von der Zellzyklusphase ab als bei Photonenstrahlung. Dies zeigte sich besonders deutlich anhand der DSB-Reparaturgeschwindigkeit in
der S- und G2-Phase. Die Zellen waren bei 12C-Ionen-Strahlung stärker auf die Reparatur
durch homologe Rekombination (HRR) angewiesen als bei Photonenstrahlung.
Die Ursache dafür, dass 12C-Ionen- gegenüber Photonenstrahlung schwerer zu reparierende DSBs erzeugte, die langsamer und eher durch HRR repariert wurden, war höchstwahrscheinlich eine stärkere Clusterung der DSBs aufgrund der höheren Ionisationsdichte von
12C-Ionen-Strahlung. Die mikroskopische Untersuchung von immunfluoreszent markiertem
γH2AX zeigte, dass die DSB-Reparaturfoci bei 12C-Ionen-Strahlung größer waren und mehr
γH2AX-Moleküle enthielten (stärkere Fluoreszenz), obwohl ihre Anzahl vor Abschluss der
Reparatur geringer war. Neben den Foci wurde auch ein schwächeres pan-nukleäres γH2AXSignal beobachtet, das linear mit der Strahlendosis anstieg und bei 12C-Ionen-Strahlung
stärker ausgeprägt war als bei Photonenstrahlung. Pan-nukleäres γH2AX als Folge von ionisierender Strahlung wird mit kleinen DNA-Fragmenten in Zusammenhang gebracht. Diese
Indizien sprachen dafür, dass die Clusterung der DSBs, und nicht allein ihre Anzahl, ausschlaggebend für die hohe relative biologische Wirksamkeit der 12C-Ionen-Strahlung ist.
Weitere Hinweise auf geclusterte DSBs nach 12C-Ionen-Strahlung lieferten Untersuchungen der Reparaturfoci nach Immunfärbung von γH2AX und dem HRR-Enzym pBRCA1 mit
Hilfe superauflösender Mikroskopie. Hierzu wurden die Zellen mit einzelnen bis einigen wenigen 12C-Ionen unter einem flachen Winkel bestrahlt. Durch Einsatz von strukturierter Beleuchtung (SIM) gelang es die Foci und ihren Kolokalisationsgrad im Verlauf der Reparatur
mit einer hohen Genauigkeit jenseits der klassischen Auflösungsgrenze in 3D zu vermessen.
Neben den primär entlang der Ionenflugbahn induzierten Foci traten nach 26 h neue Sekundärfoci auf. Diese waren abweichend von der Ionenflugbahn verteilt und gingen vermutlich
im Zuge der DNA-Replikation aus verbleibenden Nicht-DSB-Schäden hervor. In Übereinstimmung mit der Abhängigkeit solcher Sekundärfoci von der Reparatur durch Bruch-induzierte
i Replikation, einer Sonderform der HRR, wiesen die sekundären γH2AX Foci einen besonders hohen Kolokalisationsgrad mit pBRCA1 auf. Die innere Struktur der γH2AX Foci wurde
mit SPDMPhymod, einer weiteren superauflösenden Mikroskopietechnik untersucht. Hierbei
stellte sich heraus, dass die Foci, die Größen bis über 1,5µm3 erreichen, nicht homogen aufgebaut sind, sondern über eine feine Substruktur verfügen. Demnach bestehen die Foci aus
vielen Subfoci in der Größenordnung von 100 nm mit teilweise länglicher Gestalt. Passend
zur Organisation des Chromatins in dicht gepackten Schlaufen mit Interchromatin-Lücken
ließen sich unterschiedliche Verläufe und Abstände zwischen den Subfoci erkennen.
ii SUMMARY
Heavy ion rdiation has greater biological effectiveness than the same physical dose of photon
radiation. In this work the underlying reasons in the DNA damage response were analyzed
in U87 glioblastoma cells. DNA double-strand breaks (DSBs) are the decicive lesions for the
effectiveness of ionizing radiation. Their induction and repair was measured in the context of
the cell cycle based on the DSB marker γH2AX (the phosphorylated form of the histone variant H2AX). Further, radiation-specific differences in choice of the DSB repair pathway was
analyzed, as well as the consequences of repair failure. The results showed that in contrast
to photons, 12C ion radiation produces more severe DSBs that are repaired delayed and with
slower kinetics. Accordingly, stronger and longer lasting cell cycle delays, predominantly at
the G2/M border, and a higher rate of apoptosis was detected for 12C ion radiation. Autophagy, an alternative mechanism of programmed cell death, was not relevant for neighter of
the two types of radiation. The effect of 12C ion radiation was less dependent on the cell cycle
stage than for photon radiation. This became particularly evident in the DSB repair velocities
during S- and G2-phase. After 12C ion radiation, cells were more dependent on homologous
recombination repair (HRR) compared to photon radiation.
The reason therefore that in contrast to photons, 12C ion radiation induced graver DSBs
that were repaired slower and more dependent on HRR, was most probably enhanced clustering of DSBs due to the higher ionization density of 12C ion radiation. Microscopic inspection
of immunofluorently stained γH2AX revealed that 12C ion radiation induced bigger DSB repair foci containing more γH2AX molecules (higher fluorescence intensity), although their
initial number was smaller. Besides the foci, a weaker pan-nuclear γH2AX staining was observed that increased in a dose-dependent manner and was more pronounced for 12C ion
compared to photon radiation. Pan-nuclear γH2AX caused by ionizing radiation can be linked to the induction of small DNA fragments. These results indicated that the clustering of
DSBs, rather than their sheer number, is decicive for the high relative biological effectiveness
of 12C ion radiation.
Further hints for clustered DSBs after 12C ion radiation were found by application of superresolution microscopy to analyze repair foci after immunofluorescent staining of γH2AX and
the HRR enzyme pBRCA1. Therefore, cells were irradiated with individual or only few 12C
ions under a flat angle. With the help of structured illumination microscopy (SIM), the foci
and their colocalization could be measured with high accuracy beyond the classical resolution limit in 3D. Besides primary foci induced along the ion trajectory, new secondary foci
appeared after 26 h. They were scattered offside the ion track and were presumably caused by unrepaired non-DSB lesions in the course of DNA replication. In accordance with the
dependency of such secondary DSBs on repair by break-induced replication, a HRR subpathway, colocalization between γH2AX and pBRCA1 was particularly high in the secondary foci.
The inner structure of γH2AX foci was further analyzed with SPDMPhymod, another superresolution microscopy technique. This revealed that the foci, that can reach sizes up to more
iii
than 1,5µm3, posess a fine substructure rather than being homogenous. The results indicated that the foci are composed of several subfoci in the range of 100 nm with partially
elongated shape. In accordance with the organization of chromatin in densly packed loops
with interchromatin spaces, different structures and distances between the subfoci could be
observed.
iv VORWORT
Die vorliegende Arbeit ist in Kooperation mit den folgenden Arbeitsgruppen und Instituten
entstanden:
• Klinische Kooperationseinheit Molekulare Radioonkologie (DKFZ, Prof. Dr. Dr. Peter E.
Huber) und Strahlentherapie (Universitätsklinikum Heidelberg, Prof. Dr. Klaus-Josef
Weber)
• Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum (Universitätsklinikum Heidelberg)
• AG DNA Repair and Epigenomics (Dr. Peter Schmezer), Abteilung Epigenomik und
Krebsrisikofaktoren (DKFZ, Prof. Dr. Christoph Plass)
• AG Biophysik der Genomstruktur, Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie (Universität Heidelberg, Prof. Dr. Dr. Christoph Cremer)
• Institut für Angewandte Physik und Messtechnik (Universität der Bundeswehr München, Prof. Dr. Günther Dollinger)
• AG Strahlenbiologie, Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie
(Klinikum der Universität München, PD Dr. Anna Friedl)
Ich bedanke mich an dieser Stelle herzlich bei allen Beteiligten für das angenehme Arbeitsklima und die gute Zusammenarbeit, die diese Dissertation erst ermöglicht haben.
Die Etablierung und Weiterentwicklung von Methoden stellte einen wesentlichen Teil dieser
Doktorarbeit dar; einige Methoden waren zu Beginn nicht in den Arbeitsgruppen verfügbar, einige wurden erweitert oder vollkommen neu entwickelt. Dies betrifft insbesondere
die Auswertung der gewonnenen Daten mit Hilfe von neu implementierten Softwarelösungen. Um diesem Umstand Rechnung zu tragen, gibt es neben dem Kapitel Materialien und
Standardmethoden ein separates Kapitel Methodenentwicklung. Es beschreibt und begründet
die systematische Entwicklung der Methoden anhand von Ergebnissen aus Vorversuchen.
Im Kapitel Ergebnisse werden die Hauptversuche beschrieben, welche mit den erarbeiteten
Protokollen durchgeführt wurden.
v DANKSAGUNG
Ich bedanke mich bei Prof. Peter Huber dafür, dass er mir diese Doktorarbeit ermöglicht hat.
Er vertraute mir die Planung der Arbeit in weiten Teilen an und ließ mir viel Freiraum bei
der Umsetzung. Dennoch war er stets für mich da, wenn ich Hilfe brauchte. Vielen Dank für
das entgegengebrachte Vertrauen und die Unterstützung mit Rat und Tat!
Vielen Dank auch an Prof. Christoph Cremer, für die großartige Möglichkeit zur Anwendung
der superauflösenden Mikroskopie auf dem Gebiet der strahlenbiologischen Forschung. Prof.
Cremer bewies nicht nur ein Auge für das aller Kleinste, sondern auch viel Weitblick für das
große Ganze.
In diesem Zuge möchte ich mich außerdem bei Dr. Manuel Gunkel, Dr. Rainer Kaufmann und
Dr. Gerrit Best bedanken, die ich als Kollegen in der AG Cremer kennengelernt habe und seitdem auch als Freunde schätze. Sie führten in die Welt der superauflösenden Mikroskopie ein
und halfen mir bei zahlreichen Bildanalysen. Besonders möchte ich Gerrit Best danken, der
mich vieles über wissenschaftliche Bildverarbeitung lehrte und der Fourier-Transformation
ein wenig von ihrem Schrecken nahm.
Mein Dank gilt außerdem Dr. Patrick Müller und Prof. Michael Hausmann, für die vielen
wissenschaftlichen Diskussionen, die von unschätzbarem Wert für die Interpretation einiger
Ergebnisse waren.
Vielen Dank an Dr. Peter Schmezer und Prof. Klaus-Josef Weber, die mich neben Prof. Huber
und Prof. Cremer im Rahmen meines thesis advisory commitees beraten haben und mir Halt
und wichtige Impulse bei der Projektplanung gaben.
Ich bedanke mich für die gute Zusammenarbeit bei der AG Schmezer und insbesondere bei
Otto Zelezny und Reinhard Gliniorz.
Weiterhin möchte ich mich bei meinen Kolleginnen Dr. Christin Glowa und Dr. Maria Saager bedanken, die immer ein offenes Ohr für mich hatten, sowie bei Thomas Regiert, Sylvia
Trinh, Dr. Ute Wirkner und Alexandra Tietz-Dalfuß für die Unterstützung bei der Durchführung der Experimente.
Dr. Nils Nicolay danke ich für die Durchsicht dieser Arbeit. Sein feines redaktionelles Gespür
hat wesentlich zur Qualität dieser Dissertation beigetragen. Außerdem bedanke ich mich bei
Carolin Lange, die mir einen großen Dienst als Lektorin erwiesen hat.
Meinen Eltern bin ich unermesslich dankbar, dass sie stets an mich geglaubt und mich unentwegt unterstützt und gefördert haben. Auch meinen Schwiegereltern möchte ich danken,
vor allem für die Unterstützung während der Fertigstellung dieser Dissertation.
Zu guter Letzt möchte ich mich für die große Geduld und das Verständnis, das eine Doktorarbeit ab und zu einfordert, bei meiner Ehefrau Stephanie bedanken. Ihr und unserer Tochter
Elena widme ich diese Arbeit.
vi INHALTSVERZEICHNIS
1. Einführung 1
1.1. Ionisierende Strahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1. Dosisbegriffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2. Wechselwirkungen ionisierender Photonenstrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.3. Wechselwirkungen von Schwerionenstrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2. Strahlentherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1. Klinische Relevanz der Teilchentherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2. Die Phasen der biologischen Wirkung ionisierender Strahlung . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3. DNA-Schäden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3.1. DNA-Doppelstrangbrüche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4. Die DNA-Schadensantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4.1. Schadenserkennung und Signalverstärkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4.2. Weiterleitung von Schadenssignalen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.4.3. γH2AX als DSB-Marker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.5. DNA-Reparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.5.1. DSB-Reparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.5.2. Basenexzisionsreparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.5.3. Nukleotidexzisionsreparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.5.4. Fehlpaarungsreparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.5.5. Weitere Reparaturmechanismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.5.6. Fehlertoleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.6. Biologische Spätfolgen von DNA-Schäden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.6.1. Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.6.2. Autophagozytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.6.3. Seneszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.7. Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.7.1. Lokalisationsmikroskopie (SPDMPhymod) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.7.2. Strukturierte Beleuchtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2. Materialien und Standardmethoden 40
2.1. Allgemeine Laborgeräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2. Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.1. Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.2. Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.3. Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.4. Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.5. Kultivierung von U87 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.2.6. Wachstumskurve U87 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.2.7. Kultivierung von MRC-5 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3. Bestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.3.1. Dosimetrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.4. Proteinanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.4.1. Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.4.2. Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.4.3. Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.4.4. Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4.5. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
vii
Inhaltsverzeichnis
2.4.6. SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.4.7. Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.5. Immunfluoreszenz-Färbungen für Mikroskopie und FACS . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.5.1. Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.5.2. Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.5.3. Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.5.4. Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.5.5. Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.6. Datenerhebung und statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3. Methodenentwicklung 57
3.1. Durchflusszytometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.1. Berücksichtigung von Zellzyklus und Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.2. Erweiterte Apoptose-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.1.3. Erweiterte Zellzyklus-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.1.4. Das vollständige Protokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.1.5. Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2. HCS Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.2.1. Protokollabwandlungen der Immunfärbung und ihr Einfluss auf die Messergebnisse . . 68
3.2.2. Das optimierte Protokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.2.3. Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.3. Kombination von Durchflusszytometrie und HCS Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4. Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4.1. Einfluss verschiedener Eindeckmedien auf das Bleich- und Blinkverhalten der Fluorophore 73
3.4.2. Optimierung und Erweiterung der Immunfluoreszenz-Färbung . . . . . . . . . . . . . . 74
3.4.3. Das optimierte Protokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.4.4. Aufnahmesequenz am SIM-SPDM Kombimikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.4.5. Auswertealgorithmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.4.6. Entfaltung der 3D-Weitfeld-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.4.7. Auswertung der SIM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.4.8. Auswertung der SPDM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.4.9. Überlagerung von SIM und SPDM Bildern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.4.10. Ergebnisse aus methodischer Sicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4. Ergebnisse 91
4.1. Dosis-Wirkung von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4.1.1. Die relative Wirksamkeit von 12C-Ionen variiert mit der Zellzyklusphase und der Dosis . 91
4.1.2. 12C-Ionen und Photonen verursachen qualitativ unterschiedliche DSB-Foci . . . . . . . 94
4.1.3. γH2AX kommt nicht ausschließlich in DSB-Foci vor, sondern auch pan-nukleär . . . . . 99
4.2. Folgen von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung im Zeitverlauf . . . . . . . . . . . . . . . 101
4.2.1. DSBs durch Photonen werden effizienter repariert als 12C-Ionen-induzierte . . . . . . . 101
4.2.2. Unterschiede in der Reparaturkinetik hängen wahrscheinlich mit der Qualität der DSBFoci zusammen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4.2.3. Homologe Rekombination spielt bei 12C-Ionen-Strahlung eine besonders wichtige Rolle
für die DSB-Reparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4.2.4. 12C-Ionen verursachen stärkere und länger anhaltende Zellzyklusblockaden als Photonen109
4.2.5. 12C-Ionen lösen Apoptose effizienter aus als Photonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
4.2.6. Autophagozytose spielt keine Rolle für die Strahlenantwort in U87 Zellen . . . . . . . . 116
4.3. Struktur von DSB-Reparaturfoci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen . . . . . . . . . 118
4.3.1. Im Zeitverlauf zeigen sich primäre und sekundäre DSB-Reparaturfoci . . . . . . . . . . 118
4.3.2. Foci Substruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
5. Diskussion 127
5.1. DSBs, γH2AX und relative Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
5.2. DSB-Reparatur und Schadenskomplexität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
5.3. Irreparable DSBs und ihre Spätfolgen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
viii
Inhaltsverzeichnis
5.4. Neue Erkenntnisse zur Feinstruktur von DSB-Reparaturfoci durch superauflösende Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
5.4.1. Sekundärfoci tragen zur Wirkung von 12C-Ionen bei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
5.4.2. γH2AX-Foci bestehen aus vielen kleineren Subfoci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.4.3. 12C-Ionen verursachen H2AX- und BRCA1-Phosphorylierung auch abseits ihrer Flugbahn 137
5.5. Potenzielle Schlussfolgerungen für die klinische Strahlentherapie mit Schwerionen . . . 138
A. Anhang 142
A.1. MATLAB Algorithmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
A.1.1. Allgemeine Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
A.1.2. Funktionen für 3D-Weitfeldbilder . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
A.1.3. Funktionen für SIM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
A.1.4. Funktionen für SPDM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
A.1.5. Funktionen zur Kombination von SIM- und SPDM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . 168
A.2. Fits der DSB-Reparaturkinetik in Abschnitt 4.2.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
A.3. Analyse der Signaldistanzen in den SPDM-Daten aus Abschnitt 4.3.2 im Vergleich zu
Zufallsverteilungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
Literaturverzeichnis I
ix ABBILDUNGSVERZEICHNIS
1.1. Das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2. Klassische Streuung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3. Fotoionisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4. Comptonstreuung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.5. Paarbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.6. Kernfotoeffekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.7. Dosisprofile von Photonen-, Protonen- und 12C-Ionen-Strahlung . . . . . . . . . . . . 8
1.8. Biologische Folgen ionisierender Strahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.9. Schadenserkennung und Signalverstärkung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.10. Einleitung von Zellzyklusblockaden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.11. Transkriptionales Netzwerk von p53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.12. Nicht-homologe End-zu-End Verbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.13. Homologe Rekombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.14. Basenexzisionsreparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.15. Nukleotidexzisionsreparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.16. Fehlpaarungsreparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.17. Apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.18. Makroautophagozytose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.19. PSF und mikroskopischen Abbildung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
1.20. Moiré-Effekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.21. SIM-Prinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.1. Wachstum von U87 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2. Bestrahlungsanordnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.3. Einfluss der Bestrahlungsanordnung auf das γH2AX-Signal (FACS-Messung) . . . . . 46
2.4. Aufbau der Blot-Anordnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.5. HCS Mikroskop (MetaSystems) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.1. FACS-Fixierung: Einfluss auf die Zellzyklusmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.2. FACS-Fixierung: Einfluss auf das γH2AX-Signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.3. Validierung des Casp3*-AK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.4. Abtrennung von Zelltrümmern und -haufen zur korrekten Zellzyklus- und subG1Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.5. Validierung der subG1-Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.6. FACS-Auswertung: Unterteilung der Subpopulationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.7. HCS-Mikroskopie: Einfluss von Protokollabwandlungen auf die Zellkerngröße . . . . 68
3.8. HCS-Mikroskopie: Einfluss von Protokollabwandlungen auf die γH2AX-Färbung . . . 69
3.9. Aufbau des SIM-SPDM Kombimikroskops . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.10. Optimierung der Immunfärbung für 3D-SIM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.11. Kontrolle von Signalüberlappungen bei der SIM-Aufnahme . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.12. SIM Beleuchtungsmuster und Aufnahmesequenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.13. Flussdiagramm zur Auswertung von SIM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.14. SIM Bleichkorrektur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.15. Probendrift während einer SIM-Aufnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.16. Flussdiagramm zur Auswertung von SPDM-Aufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.17. Driftkorrektur für Lokalisationsaufnahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.18. Auflösungsverbesserung durch 3D-SIM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
x Abbildungsverzeichnis
3.19. Auflösungsverbesserung durch SIM und SPDM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
4.1. Klonogenes Überleben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4.2. Dosis-Wirkung von Photonen und 12C-Ionen: Zellzyklusspezifische γH2AX-Fluoreszenz 92
4.3. Zellzyklusanalyse 30 min nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . 93
4.4. Beispielaufnahmen der HCS Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4.5. Dosis-abhängige Eigenschaften der γH2AX-Färbung 30 min nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.6. Verteilung der γH2AX Fokusanzahl/Zellkern bei gleicher Dosis Photonen oder 12C-Ionen 96
4.7. Verteilung der mittleren γH2AX Fokusfläche bei gleicher Dosis Photonen oder 12C-Ionen 97
4.8. Dosis-abhängige Eigenschaften der γH2AX-Färbung 30 min nach Bestrahlung mit 12CIonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.9. Dosis-abhängige Verteilung der Anzahl an γH2AX Foci pro Zellkern nach 12C-IonenBestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.10. NN4-Distanzen der γH2AX-Signale nach Bestrahlung mit 12C-Ionen (SPDM) . . . . . 100
4.11. Reparaturkinetik nach 1 Gy Photonen oder 12C-Ionen: Zellzyklusspezifische γH2AXFluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
4.12. Reparaturkinetik nach 4 Gy Photonen oder 12C-Ionen: Zellzyklusspezifische γH2AXFluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.13. Kenngrößen der DSB-Reparaturkinetik nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen 105
4.14. Reparaturkinetik nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen: γH2AX Foci . . . . 107
4.15. DSB-Reparatur durch HRR nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . 108
4.16. Zellzyklusanalyse nach 1 Gy Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
4.17. Zellzyklusanalyse nach 4 Gy Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.18. Veränderungen der Zellkerngröße nach 1 Gy Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . 112
4.19. Veränderungen der Zellkerngröße nach 4 Gy Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . 113
4.20. Zellzyklus-Regulation nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . . 114
4.21. Apoptose nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . 115
4.22. Zellzyklusanalyse der Casp3*+ Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.23. Autophagozytose nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen . . . . . . . . . . . 117
4.24. Schnittbilder von γH2AX und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
(SIM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
4.25. 3D Ansichten von γH2AX und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
(SIM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
4.26. Größe und Form von γH2AX und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
(SIM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
4.27. Eigenschaften der γH2AX und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
(SIM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
4.28. Kolokalisation von γH2AX und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
im Zeitverlauf (SIM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
4.29. Zellkern- und DNA-Volumen nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen . . . . . . . . . . 123
4.30. Innere Struktur der γH2AX Foci. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
4.31. SPDM-basierte Clusteranalyse der γH2AX-Signale nach Schrägbestrahlung . . . . . . 125
4.32. Eigenschaften der γH2AX Subfoci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen (SPDM) . . 126
A.1. Distanzen von γH2AX-Signalen in SPDM-Daten im Vergleich zu Zufallsverteilungen . 172
xi TABELLENVERZEICHNIS
1.1. Superauflösende Mikroskopietechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.1. Kenngrößen der eingesetzten Strahlenquellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1. Einstellungen des LSR II Durchlusszytometers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2. Kompensationsmatrix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3. Protokollabwandlungen der Immunfärbung für HCS Mikroskopie . . . . . . . . . . . . 68
3.4. Bleich- und Blinkverhalten zweier Fluorophore in verschiedenen Eindeckmedien . . . . 73
3.5. Aufnahmesequenz am SIM-SPDM Kombimikroskop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.6. Algorithmenübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
xii
ABKÜRZUNGEN
1°AK Primärantikörper
2°AK Sekundärantikörper
3D Dreidimensional
ABRA1 BRCA1-A complex subunit Abraxas
Acinus Apoptotic chromatin condensation
inducer in the nucleus
AcOH Essigsäure, bzw. Acetat
AIF Apoptisis-inducing factor 1
Akt Proteinkinase B
AMP Adenosinmonophosphat
AP Basenfehlstelle (engl. apurinic od.
apyrimidinic site)
APE-1 AP endonuclease 1 (auch DNA(apurinic or apyrimidinic site) lyase)
APS Ammoniumpersulfat
ATCC American Type Culture Collection
ATG Adenosintriphosphat
ATM Ataxia telangiectasia mutated
ATR Ataxia telangiectasia and
Rad3-related protein
ATRIP ATR-interagierendes Protein
BER Basenexzisionsreparatur
BIR Bruch-induzierte Replikation
BLM Bloom syndrome protein
B-NHEJ Backup-NHEJ
BRCA1 Breast cancer type 1 susceptibility
protein
BRCA2 Breast cancer type 2 susceptibility
protein
BSA bovines Serumalbumin
CAD Caspase-aktivierte DNase (auch DNA
fragmentation factor subunit β, kurz
DFFB)
Casp3* Aktivierte Caspase-3
CERN Conseil Européen pour la Recherche
Nucléaire (Europäische Organisation
für Kernforschung)
CDKs Cyclin-abhängige Kinasen (engl.
cyclin-dependent kinases)
Chk1 Checkpoint kinase 1
Chk2 Checkpoint kinase 2
CSA Cockayne Syndrome-A
CSB Cockayne Syndrome-B
CtIP CtBP-interacting protein (auch DNA
endonuclease RBBP8,
Retinoblastoma-binding protein 8)
DAPI 4',6-Diamidin-2-phenylindol
DDB 1 DNA damage-binding protein 1
DDB 2 DNA damage-binding protein 2
DFFA DNA fragmentation factor subunit α
DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.
deoxyribonucleic acid)
Dna2 DNA replication ATP-dependent
helicase/nuclease DNA2
DNA-PK DNA-abhängige Proteinkinase
DNA-PKcs Katalytische Untereinheit der DNA-PK
(engl. DNA-PK catalytic subunit)
DSB DNA-Doppelstrangbruch
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure bzw.
Ethylendiamintetraacetat
EME1 Crossover junction endonuclease
EME1
EMEM Eagle’s Minimal Essential Medium
Endo G Endonuklease G
ER Endoplasmatisches Retikulum
ERCC1 DNA excision repair protein ERCC-1
Exo1 Exonuklease 1
FACS Durchflusszytometrie (engl.
fluorescence activated cell sorting)
FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid (oxidierte
Form)
FADD Fas-associated death domain protein
FADH2 Flavin-Adenin-Dinukleotid
(reduzierte Form)
xiii
Abkürzungen
FasL Fas antigen ligand
FCS Fötales Kälberserum (engl. fetal calf
serum)
FIP200 FAK family kinase-interacting protein
of 200 kDa (auch RB1-inducible
coiled-coil protein 1)
GEN1 Flap endonuclease GEN homolog 1
GG-NER global genome NER
GSI GSI Helmholtzzentrum für
Schwerionenforschung (früher
Gesellschaft für
Schwerionenforschung)
γH2AX Phospho-H2AX (Ser139)
H2AX Histon H2AX
HCS high content screening
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1piperazinyl)-ethansulfonsäure
HIT Heidelberger
Ionenstrahl-Therapiezentrum
HRP Meerrettichperoxidase (engl.
horseradish peroxidase)
HRR DSB-Reparatur durch Homologe
Rekombination (engl. homologous
recombination repair)
Hsc70 heat shock cognate 71 kDa protein
HZDR Helmholtzzentrum
Dresden-Rossendorf
IgG Immunglobulin G
JNK1 c-Jun N-terminale Kinase
KAP-1 KRAB-associated protein 1 (auch
transcription intermediary factor
1-beta, kurz TIF1-β)
KDF Khoros Datenformat
LAMP-2A Lysosome-associate membrane
protein 2A
LHC Großer Hardronen-Speicherring
(engl. Large Hardron Collider)
Lig I DNA-Ligase I
Lig III DNA-Ligase III
Lig IV DNA-Ligase IV
LinAc Linearbeschleuniger (engl. linear
accelerator)
MCM minichromosomal maintenance
Komplex
MCPH1 Microcephalin
MLH1 MutL protein homolog 3
MMR Fehlpaarungsreparatur (engl.
mismatch repair)
Mre11 Meiotic recombination 11 homolog A
(auch double-strand break repair
protein MRE11A)
MRN Mre11/Rad50/Nbs1
(Proteinkomplex)
MSH2 MutS protein homolog 2
MSH3 MutS protein homolog 3
mTOR Mechanistic target of rapamycin
MutLα hMLH1-hPMS2-Heterodimer
MutSα hMSH2-hMSH6-Heterodimer
MutSβ hMSH2-hMSH3-Heterodimer
Mus81 Crossover junction endonuclease
MUS81
NA Numerische Apertur
NAD+ Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
(oxidierte Form)
NBS1 Nibrin (auch Nijmegen breakage
syndrome protein 1, cell cycle
regulatory protein p95)
NER Nukleotidexzisionsreparatur
NF Niederfrequenz
NHEJ Nicht-homologe
End-zu-End-Verknüpfung
OTF Optische Übertragungsfunktion (engl.
optical transfer function)
p21 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1
p53 Cellular tumor antigen p53
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PALB2 Partner and localizer of BRCA2
PARP-1 Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1
pBRCA1 Phospho-BRCA1 (Ser1524)
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (engl.
phosphate buffered saline),
Formulierung nach Dulbecco
PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl.
polymerase chain reaction)
PCNA Proliferating cell nuclear antigen
pH3 Phospho-Histon H3 (Ser10)
PI Propidiumiodid
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
PMS2 PMS1 protein homolog 2
Pol II RNA-Polymerase II
Polβ DNA-Polymerase β
Polδ DNA-Polymerase δ
Pol DNA-Polymerase 
xiv
Abkürzungen
Polλ DNA-Polymerase λ
pRad52 Phospho-Rad52 (Tyr104)
PVDF Polyvinylidenfluorid
PSF Punktbildfunktion (engl. point-spread
function)
PTEN Phosphatase and tensin homolog
Rad50 DNA repair protein RAD50
Rad51 DNA repair protein RAD51 homolog 1
Rad52 DNA repair protein RAD52 homolog
RAP80 BRCA1-A complex subunit RAP80
(auch receptor-associated protein 80)
RBW Relative biologische Wirksamkeit
RDW Relative dosisäquivalente
Wirksamkeit
RFC Replication factor c
RöV Verordnung über den Schutz vor
Schäden durch Röntgenstrahlen
(Röntgenverordnung)
RNA Ribonukleinsäure (eng. ribonucleic
acid)
RNase Ribonuklease
RNF8 E3 ubiqiutin-protein ligase RNF8
(auch RING finger protein 8)
RPA Replication protein A
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat (engl. sodium
dodecyl sulfate)
SDS-PAGE NatriumdodecylsulfatPolyacrylamidgelelektrophorese
SI Système Internattional d’Unités
SIM Mikroskopie mit strukturierter
Beleuchtung (engl. structured
illumination microscopy)
SLX1 Structure-specific endonuclease
subunit SLX1
SLX4 Structure-specific endonuclease
subunit SLX4
SOBP Spread-out Bragg-Peak
SPDM Spectral precision distance
microscopy
StrlSchV Verordnung über den Schutz vor
Schäden durch ionisierende Strahlen
(Strahlenschutzverordnung)
TC-NER Transcription-coupled NER
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
Tip60 60 kDa Tat-interactive protein (auch
histone acetyltransferase KAT5)
TLS Translesion synthesis
TNF-α Tumornekrosefaktor
TNF-R Tumornekrosefaktor-Rezeptor
TRAIL Tumornekrosefaktor-verwandter
Apoptose-induzierender Ligand (engl.
TNF-related apoptosis-inducing
ligand)
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Tris-HCl Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid
Ubc13 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N
ULK1 Unc-51-like kinase 1 (auch Atg1)
ÜN Über Nacht
ÜS Überstand
UV Ultraviolett
UV/Vis Ultraviolettes und sichtbares Licht
(200–1100 nm Wellenlänge)
V(D)J Variable diversity joining
WRN Werner syndrome ATP-dependent
helicase
XLF XRCC4-like factor (auch
non-homologous end-joining factor 1,
Cernunnos)
XPA-XPG Xeroderma pigmentosum group A-G
complementing protein
XRCC1 X-ray repair cross-complementing
protein 1 (auch DNA repair protein
XRCC1)
XRCC4 X-ray repair cross-complementing
protein 4 (auch DNA repair protein
XRCC4)
xv 1 EINFÜHRUNG
1.1. Ionisierende Strahlung
Als Strahlung bezeichnet man allgemein die räumliche und zeitliche Ausbreitung von Teilchen oder Wellen und den damit verbundenen Energietransport. Im engeren Sinne versteht
man unter Teilchenstrahlung (auch Partikelstrahlung oder Korpuskelstrahlung genannt) den
Transport von energiereichen Atomen, Ionen, Elektronen oder anderen Elementarteilchen,
die eine von Null verschiedene Ruhemasse besitzen. Im Gegensatz dazu steht die Wellenstrahlung, die den Transport von Energie ohne Übertragung von Teilchen mit eigener Masse
meint. Im Wesentlichen wird darunter jede Form der elektromagnetischen Strahlung verstanden, bei der im Sinne des Welle-Teilchen-Dualismus Photonen, die Quanten des elektromagnetischen Felds die Energie transportieren.
Übersteigt die Energie der strahlenden Photonen oder Masseteilchen einige Elektronenvolt, so spricht man von ionisierender Strahlung1, da die Energie ausreicht, um Elektronen
aus der Atomhülle zu schlagen, so dass ein geladenes Ion zurückbleibt. Die minimale Ionisationsenergie entspricht der Bindungsenergie der Valenzelektronen eines einzelnen Atoms oder
Moleküls und beträgt typischerweise etwa 15 eV [1]. Im Wasser oder innerhalb von menschlichem Gewebe sind etwa 30 eV für eine Ionisation erforderlich. Kurzwelliges ultraviolettes
(UV) Licht liegt an der Grenze zu diesem Energiebereich. Für die Strahlentherapie ist jedoch
nur ionisierende Strahlung ab 10 keV von Bedeutung, also Röntgen- und γ-Strahlung (bis
50 MeV [2]) oder noch energiereichere Teilchenstrahlung. Zur Einordnung zeigt Abbildung
1.1 das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung anhand ihrer verschiedenen Erscheinungsformen und Energiebereiche.
Zur Teilchenstrahlung zählen α- und β -Strahlung, die bei radioaktiven Zerfallsprozessen
(dem α-, beziehungsweise β-Zerfall) entstehen, sowie Protonenstrahlung und Schwerionenstrahlung, die Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist. Bei der β-Strahlung handelt es sich
um freie Elektronen (β–-Zerfall) oder Positronen (β+-Zerfall), bei α-Strahlung um schnelle
4He-Kerne, also strahlende Heliumionen. Strahlende Ionen mit höheren Massenzahlen als
Helium werden als Schwerionen bezeichnet.
Besonders energiereiche Schwerionen finden sich im Spektrum der kosmischen Strahlung.
Sie können Energien von einigen GeV (typisch für Sonneneruptionen), bis hin zu über 1019 eV
(seltene extragalaktische Teilchen) erreichen [3]. Häufig handelt es sich um C-, O-, Ne-,
Mg-, Si- und Fe-Ionen (geradzahlige Massenzahlen kommen häufiger vor als ungerade). Die
meisten kosmischen Schwerionen können nicht bis zur Erdoberfläche vordringen. Sie werden durch das Erdmagnetfeld abgelenkt oder in der Atmosphäre absorbiert, wo sie in einer
Kaskade von Wechselwirkungen (siehe Abschnitt 1.1.3) Teilchenschauer erzeugen (Höhenstrahlung).
1im Strahlenschutz wird Strahlung ab 5 keV als ionisierend festgelegt (§ 1 RöV, § 2 StrlSchV). Dies hat jedoch
rein administrative Gründe und entspricht keinen tatsächlichen Ionisationsenergien.
1
Kapitel 1: Einführung
EGGETGTGG
Strahlungs2
art
Röntgen2
strahlung γ2StrahlungRadiowellen
Mikro2
wellen
Infrarot26
strahlung UVNF
7GG ZTG ZGG TTG
Für6den6Menschen6sichtbares6Licht
Wellenlänge6in6nm
Wellenlänge
in6m6(in6Luft)
HGGG6km
HGZ HGE
H6km H6m H6µm H6nmH6mm H6pm
HGz HGG HG2z HG2E HG2Z HG28 HG2HG HG2Hz HG2HE
H6fm
Photonen2
energie6in6eV
H6peV
HG2Hz HG2HG
H6neV H6µeV H6eV H6keVH6meV H6MeV
HG28 HG2Z HG2E HG2z HGG HGz HGE HGZ HG8
H6GeV
nicht6ionisierend ionisierend
HGz HGE HGZ HG8 HGHG HGHz HGHE HGHZ HGH8 HGzG HGzz
H6kHz
Frequenz6
in6Hz
H6MHz H6GHz H6PHz H6EHzH6THz H6ZHz
Abbildung 1.1. | Das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung erstreckt sich von niederfrequenter Strahlung (NF) durch Wechselströme und Radiowellen, die für den Rundfunk genutzt werden,
über Mikrowellen, Infrarot-Strahlung, das sichtbare und ultraviolette (UV) Licht, bis hin zu energiereichen ionisierenden Strahlungsarten, wie Röntgen- und γ-Strahlung.
Künstlich kann Schwerionenstrahlung durch Beschleunigung der Ionen in einem Teilchenbeschleuniger erzeugt werden. Die elektrisch geladenen Ionen werden dabei von elektrischen
Feldern auf sehr hohe Geschwindigkeiten gebracht und ihre Flugrichtung wird durch starke
Magnetfelder kontrolliert.
1.1.1. Dosisbegriffe
Wie viel Energie Strahlung in Materie einträgt hängt sowohl von der Strahlung selbst, als
auch den Eigenschaften der Materie ab. Das physikalische Maß für die gesamte Energieabsorption in einer Masse ist die Energiedosis, oder kurz Dosis, und wird nach dem SIEinheitensystem in Gray (Gy) gemessen:
1Gy = 1
J
kg In einem lebenden Organismus können verschiedene Strahlenarten, trotz gleicher Energiedosis, unterschiedlich starke biologische Wirkungen entfalten. Die Toxizität ist zum Beispiel
abhängig vom Wirkungsquerschnitt der Strahlung, der bei Schwerionenstrahlung wesentlich
kleiner ist als bei Photonenstrahlung (siehe Abschnitt 1.1.3). Um dem Rechnung zu tragen
sind in der Radiologie gewichtete Dosisgrößen definiert. Sie werden als Äquivalentdosen angegeben, bei denen die gleiche Wirkung eintritt wie für eine gegebene Energiedosis einer
Referenzstrahlung. Äquivalentdosen berechnen sich durch Multiplikation der Referenzdosis
mit einem dimensionslosen Strahlungswichtungsfaktor, der die relative biologische Wirksamkeit (RBW) angibt:
RBW =
Dre f
Du RBW Relative biologische Wirksamkeit
Dre f Energiedosis der Referenzstrahlung
Du Äquivalentdosis der untersuchten Strahlung
(1.1)
2
Kapitel 1: Einführung
Im Strahlenschutz dient gewöhnlich 250 keV Röntgenstrahlung oder γ-Strahlung aus einer
60Co Quelle als Referenzstrahlung und die Äquivalentdosen werden zur Unterscheidung von
ungewichteten Energiedosen in der Einheit Sievert (Sv) angegeben (meist als mSv oder µSv).
Wie das Gy hat Sv die Basiseinheit Joule pro Kilogramm, weil die Angabe in Sv aber die
biologische Wirksamkeit berücksichtigt, ist sie ein von der Strahlenqualität unabhängiges
Schädigungsmaß.
Als Endpunkt für die Bestimmung von Strahlenwichtungsfaktoren wird klassischerweise
das klonogene Überleben (die Fähigkeit zur Koloniebildung durch Teilung einer einzelnen
Zelle) nach Bestrahlung von Zellen mit unterschiedlichen Energiedosen in vitro gemessen.
Je nach Fragestellung sind auch andere Endpunkte möglich; im Allgemeinen hängt das Resultat vom Endpunkt, der Reparaturkapazität der Zellen und dem betrachteten Ausmaß der
Schädigung (z.B. 50% oder 10% klonogenes Überleben) ab. Unterschiedliche Strahlenwichtungsfaktoren sind deshalb nur bedingt miteinander vergleichbar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde neben der RBW ein weiteres Vergleichsmaß für die strahlenspezifische biologische Wirksamkeit verwendet: die relative dosisäquivalente Wirksamkeit
(RDW) gibt an, wie hoch die biologische Wirkung einer Strahlung im Vergleich zur Wirkung
einer Referenzstrahlung bei gleicher Energiedosis ist.
RDW =
Wu Wre f
RDW Relative dosisäquivalente Wirksamkeit
Wu Wirkung der untersuchten Strahlung
Wre f Wirkung der Referenzstrahlung
(1.2)
Die unterschiedliche biologische Wirksamkeit verschiedener Strahlungsarten ist eine Konsequenz aus ihrer charakteristischen Art des Energieübertrags auf Materie. Die Ionisationsdichte der Strahlung scheint hierbei maßgeblich zu sein. Der lineare Energietransfer (LET)
ist ein indirektes Maß für die Ionisationsdichte, das häufig im Zusammenhang mit Partikelstrahlung verwendet wird. Der LET gibt an, wie viel Energie ein ionisierendes Teilchen pro
Längeneinheit an das durchdrungene Material abgibt und wird üblicherweise in keV·µm–1
ausgedrückt. Für ein bestimmtes Teilchen verhält sich die Ionisationsdichte proportional zum
LET. Unterschiedliche Teilchen mit gleichem LET haben jedoch unterschiedliche Ionisationsdichten, da ihr Wirkungsquerschnitt von der Teilchenenergie abhängt [4]. Entsprechend
unterscheidet sich beispielsweise die RBW von Protonen- und 12C-Ionen-Strahlung mit gleichem LET. Ungeachtet dessen ordnen viele Autoren in der strahlentherapeutischen Literatur
Photonen und Protonen in spärlich ionisierende Niedrig-LET-Strahlung und Schwerionen und
Neutronen in dicht ionisierende Hoch-LET-Strahlung ein.
Entscheidend für das Ionisationsverhalten und die biologische Wirkung von Strahlung ist
welche Wechselwirkungen in welchem Umfang ablaufen können. Im Folgenden werden die
für die Strahlentherapie relevanten Wechselwirkungen von Photonen- und Schwerionenstrahlung mit Materie beschrieben. Die Informationen stammen großteils aus [5].
1.1.2. Wechselwirkungen ionisierender Photonenstrahlung
Die Photonen der Röntgen- und γ-Strahlung können abhängig von ihrer Energie, teilweise
oder vollständig, von Materie absorbiert oder gestreut werden. Sie können dabei mit der
Atomhülle, dem elektrischen Feld der Atomkerne oder den Kernteilchen selbst wechselwirken. Die Wechselwirkungen mit der Atomhülle umfassen die klassischen Streuung, die Fotoionisation und die Compton-Streuung.
3
Kapitel 1: Einführung
Bei der klassische Streuung erfährt das Photon eine Richtungsänderung ohne Energieverlust (siehe Abb. 1.2). Hierdurch wird keine Energie an die durchstrahlte Materie (den Absorber) übertragen, die Strahlung wird jedoch dispergiert, so dass sich ein gerichteter Strahl
(ein Strahlenbündel, dass sich in eine bestimmte Richtung ausbreitet) aufweitet und dadurch
an Leistungsdichte (Intensität) verliert. Klassische Streuung tritt nur bei Photonenenergien
unterhalb von etwa 20 keV auf. In der Strahlentherapie betrifft dies nur weiche Röntgenstrahlung, die heute kaum mehr eine Rolle spielt.
E 0 Zeit
Hülle
E 0
0
0
Abbildung 1.2. | Klassischen Streuung. Links: Das Photon γ0 wird in der Elektronenhülle absorbiert,
die Elektronen schwingen kurze Zeit gemeinsam und senden die Anregungsenergie dann wieder vollständig in Form eines Photons γ
,
mit neuer Ausbreitungsrichtung aus. Rechts: Das einfallende Photon,
die Elektronenhülle und das gestreute Photon schwingen ohne Phasenverschiebung mit derselben Frequenz. Quelle: modifiziert nach [5].
Bei der Fotoionisation (auch äußerer Fotoeffekt oder einfach Fotoeffekt genannt) wird das
Photon von einem Elektron aus einer inneren Elektronenschale absorbiert, das dadurch aus
dem Atom hinausgeschleudert wird (siehe Abb. 1.3). Die Photonenenergie muss dafür die
Bindungsenergie des Elektrons übersteigen. Das freigesetzte δ-Elektron kann in der Folge
zusätzliche Wechselwirkungen auslösen, Bremsstrahlung abgeben (d.h. Photonen emittieren
wenn es gebremst oder beschleunigt wird) und weitere Atome ionisieren. Die Lücke, die das
Elektron in seinem Mutteratom hinterlässt kann zur Emission weiterer Elektronen führen, so
dass das Atom mehrfach ionisiert wird (Auger-Effekt).
eEL-K
E 0
0
Abbildung 1.3. | Fotoionisation. Links: Das Photon γ0 wird von einem Elektron in der K-Schale
absorbiert, das hierdurch dem Atom entkommt und eine Potentiallücke hinterlässt. Rechts: Die Lücke
wird durch ein Elektron aus der L-Schale aufgefüllt. Die Energie aus der Potentialdifferenz wird in
Form eines Photons γ
,
emittiert oder setzt Auger-Elektronen frei. Quelle: modifiziert nach [5].
4
Kapitel 1: Einführung
Bei der Compton-Streuung schlägt ein Photon ein schwach gebundenes (quasi freies) Elektron aus der äußeren Schale der Atomhülle und wird dabei nur teilweise absorbiert. In welchem Winkel Photon und Elektron gestreut werden, und wie viel Energie und Impuls auf das
Elektron übertragen wird, hängt von der Energie des einfallenden Photons ab: Gegenüber
der Einfallsrichtung kann das Elektron seitlich und nach vorne gestreut werden, das Photon
kann außerdem zurückgestreut werden (Streuwinkel >90°). Mit zunehmender Photonenenergie werden für beide Stoßpartner kleine Streuwinkel nahe der Vorwärtsrichtung immer
wahrscheinlicher.
eE 0, p 0
Ekin, pe
E , p
0
Abbildung 1.4. | Comptonstreuung. Das Photon γ0 überträgt einen Teil seiner Energie und seines Impulses auf ein quasi freies Hüllenelektron, das hierdurch aus dem Atom geschlagen wird. Das Photon
wird abgelenkt und fliegt mit verminderter Frequenz, beziehungsweise vergrößerter Wellenlänge weiter. Der Vorgang entspicht einem elastischen Stoß, bei dem sich Energie und Impuls des einfallenden
Photons γ0 vollständig auf das Elektron und das gestreute Photon γ
,
verteilen (unter Vernachlässigung
eines geringen Rückstoßimpulses auf das Atom). Quelle: modifiziert nach [5].
Oberhalb der Ruheenergie des Elektrons (511 keV) ist der Energieübertrag effizienter und
stärker vom Streuwinkel abhängig als darunter. Da die Elektronen mehr Energie erhalten,
erhöht sich ihre Reichweite (sie können weitere Strecken ohne Wechselwirkungen zurücklegen). Dies führt zu dem für medizinisch genutzte Photonenstrahlung typischen Dosisaufbaueffekt. Die Energie, die der Absorber aufnimmt, steigt dabei hinter der Eintrittsfläche der
Strahlung zunächst an, bevor sie aufgrund der abnehmenden Strahlintensität wieder sinkt.
In menschlichem Gewebe kann die Elektronenreichweite bei den in der Strahlentherapie
üblichen Photonenenergien mehrere Zentimeter betragen.
Im elektrischen Feld des Atomkerns tritt ab Photonenenergien von 1022 keV Paarbildung
auf (siehe Abb. 1.5). Dabei zerstrahlt das Photon in ein Elektron-Positron-Paar (das Photon
wird „vernichtet“). Auf ihrem Weg durch einen Absorber geben die entstandenen Teilchen
ihre Bewegungsenergie durch Zusammenstöße mit Atomen in vielen kleinen Portionen ab.
Die Paarbildung kann auch im elektrischen Feld eines Elektrons stattfinden. In diesem
Fall nimmt das Elektron den Differenzimpuls zwischen Photon und dem erzeugten TeilchenAntiteilchen-Paar auf. Wegen seiner geringen Masse wird das Elektron dabei stark beschleunigt und verlässt das Atom. Da diese Form der Paarbildung drei strahlende Teilchen erzeugt,
wird sie auch Triplettbildung genannt. Aus Gründen der Energie- und Impulserhaltung erfordert die Triplettbildung mindestens die doppelte Photonenenergie wie die Paarbildung im
Kernfeld.
Bei noch höheren Energien können Photonen Kernreaktionen auslösen (siehe Abb. 1.6).
5
Kapitel 1: Einführung
E 0
0
ee+ ee+E 0
0
eAbbildung 1.5. | Paarbildung. Links: Das Photon γ0 zerstrahlt im Coulombfeld eines Atomkerns
in ein Elektron und ein Positron. Das Atom erfährt dadurch einen Rückstoßimpuls, der angesichts
der Kernmasse aber nicht zu nennenswerten Bewegungen führt. Rechts: Bei der Triplettbildung zerstrahlt das Photon im Coulombfeld eines Elektrons. Das Elektron nimmt den Rückstoßimpuls auf und
wird aufgrund seiner geringen Masse so stark beschleunigt, dass es zusammen mit dem TeilchenAntiteilchen-Paar das Atom verlässt. Quelle: modifiziert nach [5].
Die Photonen werden dabei vollständig vom Kern absorbiert und erhöhen die thermische Bewegung der Kernteilchen (Protonen und Neutronen), oder regen diese zu kollektiven Schwingungen an. Übersteigt die Anregungsenergie die Separationsenergie des am schwächsten gebundenen Kernteilchens, so verlässt dieses den Kern und trägt die überschüssige Energie als
Bewegungsenergie mit sich (Kernfotoeffekt). Es können auch zwei Kernteilchen auf einmal
emittiert werden.
Die übrigen Kerne sind häufig instabil und daher radioaktiv. In radiologisch genutzten
Bestrahlungsräumen kann es deshalb zur Aktivierung von Materialien im Strahlengang kommen, zum Beispiel in der Luft oder den Wänden. Schwere Kerne, wie bei Uran, können durch
Photonen geeigneter Energie gespalten werden (Photospaltung). Reicht die Anregungsenergie nicht aus um ein Kernteilchen abzustoßen, so strahlt sie der Kern wieder in Form von
Photonen ab (Kern-Fluoreszenz).
Abbildung 1.6. | Kernfotoeffekt. Links: Ein mittelschwerer Atomkern absorbiert ein Photon. Mitte:
Die Kernteilchen werden zu thermischen oder kollektiven Schwingungen angeregt. Rechts: Übersteigt
die Anregungsenergie die Separationsenergie eines Kernteilchens, so entkommt es dem Kern und trägt
die überschüssige Energie als Bewegungsenergie mit sich. Die restlichen Kerne sind häufig instabil und
zerfallen weiter. Quelle: modifiziert nach [5].
In der medizinischen Radiologie und im Strahlenschutz stellen Fotoionisation, Comptoneffekt und Paarbildung die relevanten Wirkmechanismen für Photonenstrahlung dar. Die
Fotoionisation dominiert bei niedrigen Photonenenergien und Materialien mit hohen Ordnungszahlen wie Blei, das bei Abschirmungen für den Strahlenschutz zum Einsatz kommt.
6
Kapitel 1: Einführung
In menschlichem Gewebe, das aus vergleichsweise leichten Elementen besteht, spielt die Fotoionisation nur im Rahmen der Röntgendiagnostik eine Rolle. Für die Strahlentherapie mit
Photonen ist der Comptoneffekt zwischen 30 keV und 30 MeV von zentraler Bedeutung. Den
größten Beitrag zur biologischen Wirkung liefern dabei die sekundären Comptonelektronen. Die Paarbildung ist als Wirkmechanismus für die Strahlentherapie von untergeordneter
Bedeutung, stellt jedoch oberhalb von 10 MeV den wichtigsten Prozess für die Wechselwirkungen mit schweren Absorbern dar.
Photonenstrahlung gilt als indirekt ionisierend, da nicht die Photonen selbst, sondern die
von ihnen erzeugte Sekundärstrahlung für den Hauptteil der Ionisierungen verantwortlich
ist. Mit steigender Photonenenergie treten die Welleneigenschaften der elektromagnetischen
Strahlung immer weiter in den Hintergrund und die Teilcheneigenschaften bestimmen zunehmend den Charakter der Strahlung.
1.1.3. Wechselwirkungen von Schwerionenstrahlung
Im Gegensatz zu Photonenstrahlung wirkt Strahlung aus geladenen Teilchen direkt ionisierend. Die Teilchen geben ihre Energie portionsweise durch elektromagnetische und starke
Wechselwirkung mit Atomen und Atomkernen ab. Dabei treten Ionisierungen und Kernreaktionen auf, bei denen Sekundärteilchen frei werden. Bei ausreichend hoher Energie können
diese weitere Atome ionisieren und in einer Kaskade einen Teilchenschauer auslösen.
Hochenergetische Schwerionen werden aufgrund ihrer hohen kinetischen Energie kaum
durch Atomhüllen beeinflusst; sie müssen erst durch Zusammenstöße mit Atomkernen verlangsamt werden, um effizient mit Elektronen zu wechselwirken. Aus diesem Grund werden
Schwerionen beim Durchgang durch Materie kaum gestreut und geben den Großteil ihrer
Energie am Ende ihrer Flugbahn ab. Die Energiedeposition verhält sich proportional zum
Kehrwert der Ionenenergie. Entsprechend weist die Dosisverteilung entlang der Flugbahn
eines Schwerions einen lang gezogenen flachen Abschnitt auf, gefolgt von einer scharf begrenzten Spitze, hinter der keine weitere Dosis anfällt, bis auf eine geringe Restdosis durch
aktivierte Ionenfragmente. Die Dosisspitze wird Bragg-Peak genannt, nach William Bragg,
der sie 1904 zum ersten Mal für α-Strahlen beschrieb. Protonenstrahlung zeigt ebenfalls
einen Bragg-Peak, der jedoch nicht ganz so stark ausgeprägt ist wie bei Schwerionen (siehe
Abb. 1.7 in Abschnitt 1.2.1).
1.2. Strahlentherapie
Die Strahlentherapie beruht auf der Zerstörung von Molekülen durch das Aufbrechen chemischer Verbindungen mit Hilfe von ionisierender Strahlung (Photonenstrahlung von 10 keV bis
50 MeV und noch energiereichere Protonen- und Schwerionenstrahlung). Ziel ist es, Tumorzellen zumindest so weit zu schädigen, dass sie ihre Teilungsfähigkeit verlieren und gleichzeitig gesundes Gewebe zu schonen. Maßgeblich ist dabei die Beschädigung der DNA. Schäden an Proteinen, Lipiden und anderen austauschbaren Zellbestandteilen sind irrelevant, es
sei denn, sie lösen unmittelbar chemische Reaktionen aus, die zur Beschädigung der DNA
beitragen, oder sie verletzen die Zellintegrität so sehr, dass die Zelle ausläuft (Nekrose).
7
Kapitel 1: Einführung
1.2.1. Klinische Relevanz der Teilchentherapie
Photonen-basierte Strahlentherapie hat den Nachteil, dass die Strahlung den Körper vollständig durchdringt und somit unweigerlich auch gesundes Gewebe erreicht. Partikelstrahlung
dringt hingegen nur bis zu einer gewissen Tiefe in den Körper ein, die sich über die kinetische
Energie der Teilchen einstellen lässt. Deshalb gab es bereits in den 1940er Jahren Bestrebungen, Teilchenstrahlung für die Strahlentherapie zu nutzen. Erste klinische Studien mit
schnellen Neutronen zeigten zwar gute Tumorkontrollraten, verursachten aber zu schwere
Nebenwirkungen [6]. Spätere Studien mit Protonen und He-Ionen waren vielversprechend,
und seitdem wächst das Interesse an der Nutzung von Schwerionen, wobei sich 12C-Ionen
als besonders vorteilhaft erwiesen haben.
Bei der konventionellen Photonentherapie fällt die höchste Dosis aufgrund des Dosisaufbaueffekts (siehe Abschnitt 1.1.2) wenige Zentimeter unter der Haut an und nimmt dann
mit zunehmender Eindringtiefe exponentiell ab. Tief liegende Tumoren müssen daher aus
verschiedenen Winkeln bestrahlt werden, um die Dosis im Zielvolumen aufzusummieren
und die Schädigung von umliegendem gesunden Gewebe auf ein akzeptables Maß zu beschränken. Protonen, He- und Schwerionen weisen hingegen einen Bragg-Peak auf, der eine
erheblich genauere Dosiskonformation erlaubt (siehe Abb. 1.7). Durch Modulation der Teilchenenergie lässt sich die Lage des Bragg-Peaks verändern, um das Tumorvolumen Punkt für
Punkt in 3D abzurastern. Dabei werden mehrere verschobene Bragg-Peaks derart überlagert,
dass sich in der Summe ein möglichst glatter spread-out Bragg-Peak (SOBP) mit homogener
Dosis im Zielvolumen ergibt.
Abbildung 1.7. | Dosisprofile im Vergleich. Rechts: Photonenstrahlung zeigt beim Eindringen in
einen Absorber einen Dosisaufbaueffekt, während Protonen und 12C-Ionen einen Bragg-Peak aufweisen. Quelle: modifiziert nach [4]. Links: Durch Modulation der Teilchenenergie können mehrere
Bragg-Peaks zu einem spread-out Bragg-Peak (SOBP) überlagert werden, mit dem sich ein Tumorvolumen unter Schonung von umliegendem Gewebe genauer erfassen lässt als durch Photonenstrahlung.
Im Vergleich zu Protonen ist bei Schwerionen der Bragg-Peak ausgeprägter und das Streuverhalten günstiger. Neben den physikalischen Vorteilen bei der Dosiskonformation besitzt
Schwerionenstrahlung außerdem eine erhöhte biologische Wirksamkeit. Bei 12C-Ionen steigt
8
Kapitel 1: Einführung
die RBW auf den letzten Zentimetern der Ionenflugbahn an, und fällt in den Bereich des
Bragg-Peaks und des größten LETs. Dies ist besonders günstig, da es die Effizienz der höheren Energiedosis im Bragg-Peak nochmals erhöht. Bei schwereren Ionen tritt die maximale
RBW aufgrund von Sättigungseffekten bereits vor dem Bragg-Peak ein, bei Protonen erst im
Niedrig-Dosis-Bereich dahinter, auf den letzten Mikrometern ihrer Reichweite [4]. Für klinisch genutzte Protonenstrahlung zwischen 160 und 230 MeV werden RBW-Werte von 1,1
bis 1,2 gegenüber Photonenstrahlung angenommen, während bei der 12C-Ionen-Therapie
mit Werten zwischen 2 und 5 im Zielvolumen gerechnet wird.
Darüber hinaus scheint die Wirkung von 12C-Ionen-Strahlung weniger stark von der Zellzyklusphase und der Sauerstoffversorgung der Krebszellen abzuhängen, als bei der klassischen
Photonentherapie [7]. Vor allem bei langsam wachsenden und schlecht durchbluteten Tumoren, die sich relativ resistent gegenüber der konventionellen Behandlung zeigen, ist dies
von großem Wert.
In Deutschland wurde bereits in den 1960er Jahren über den Nutzen von Schwerionenstrahlung für die Strahlentherapie nachgedacht. Die Machbarkeit einer solchen Schwerionentherapie erforschte federführend die 1969 gegründete „Gesellschaft für Schwerionenforschung“, die heute unter dem Namen „GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung“
(GSI) bekannt ist [8]. In ihrem Sitz in Darmstadt wurde 1997 der erste Patient mit 12C-Ionen
bestrahlt. An dem Pilotprojekt, in dem bis 2008 über 400 Patienten mit verschiedenen Indikationen behandelt wurden, waren neben der GSI auch das DKFZ, die Klinik für RadioOnkologie und Strahlentherapie des Universitätsklinikums Heidelberg und das Helmholtzzentrum
Dresden-Rossendorf (HZDR) beteiligt [9,10].
Darauf aufbauend wurde das „Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum“ (HIT) des Universitätsklinikums Heidelberg konzipiert [11]. Die Grundsteinlegung erfolgte im Jahr 2005
und seit November 2009 läuft der Patientenbetrieb [12]. Das HIT ist eine bislang einzigartige klinische Einrichtung. Weltweit sind derzeit nur drei weitere Ionenstrahl-Therapiezentren in Betrieb: zwei in Japan und seit Ende 2012 eine in Italien. Das HIT ermöglicht
sowohl Schwerionen-, als auch Protonentherapien, und verfügt als Alleinstellungsmerkmal
über eine um 360° rotierbare Strahlführung (Gantry), die es erlaubt, den Patienten aus allen Raumrichtungen zu bestrahlen. Eine weitere Besonderheit ist die enge Verknüpfung der
Strahlentherapie mit der medizinischen Forschung, in deren Rahmen auch die vorliegende
Arbeit eingebettet ist.
1.2.2. Die Phasen der biologischen Wirkung ionisierender Strahlung
Die biologische Wirkung ionisierender Strahlung lässt sich in verschiedene Phasen einteilen,
die sich über Zeiträume von Sekundenbruchteilen bis hin zu Generationen erstrecken (siehe
Abb. 1.8). In der physikalischen Phase findet die Energieabsorption in der Zelle statt, wodurch
in der radiochemischen Phase Moleküle ionisiert werden und chemische Verbindungen aufbrechen. Kommt es nicht unmittelbar zur Nekrose, so ist die Entstehung von DNA-Schäden
während der biochemischen Phase wesentlich für die Entfaltung der biologischen Wirkung.
Der Erfolg von DNA-Reparaturmechanismen entscheidet über das Schicksal der Zelle und die
Folgen für den Gesamtorganismus in der biologischen Phase.
9
Kapitel 1: Einführung
IndirekterMEffekt
Radiochemv
Phase
bwOFyMsD
Biochemv
Phase
Biologische
Phase
sM−Mmin
minM−Mh
Tage
Wochen
Monate
Jahre
GeneraF
tionen
andereMVerF
änderungenMderM
Biomoleküle
ZelluläreMEbene
DirekterMEffekt
Energieabsorption
inMderMDNA
Fehlschlag
Fehlschlag verbleibendeSchäden
AkuteMStrahlenF
krankheit
Organismusebene
EntwicklungsF
störungen
Spätfolgen
Vererbliche
Effekte
Krebs
Maligne
Transformation Keimbahn
Körperzellen
PhysikalvM
Phase
bwOFwyMsD
qMSekunden
Seneszenz
Zelltod Mutationen
DNAFReparatur
DNAFSchäden
Primärradikale
undMPeroxide
[OH•AMH•AMe−aq]
Bioradikale
[R•AMRO•ö]
Energieabsorption
imMZellwasser
Energieabsorption
inMeinemManderen
Biomolekül
ZellzyklusF
arrest
Abbildung 1.8. | Biologische Folgen ionisierender Strahlung. Sofern die Zelle nicht durch Nekrose
stirbt, ist die Entstehung von DNA-Schäden wesentlich für die Entfaltung der biologischen Wirkungen
ionisierender Strahlung. Die Schäden entstehen direkt oder indirekt in der DNA und ziehen Zelltod,
Seneszenz oder Mutationen nach sich, falls ihre Reparatur misslingt. Für den Gesamtorganismus können sich Folgen ergeben, die sich mitunter erst nach langen Zeiträumen zeigen.
10
Kapitel 1: Einführung
1.3. DNA-Schäden
Es gibt eine Vielzahl verschiedener DNA-Schäden und spezialisierter Reparatursysteme um
sie zu beheben (siehe Abschnitt 1.5). Man schätzt, dass unter physiologischen Bedingungen
täglich etwa 100 000 DNA-Schäden in jeder Zelle eines Menschen auftreten [13]. Abschätzungen darüber, welche Schadensarten wie häufig vorkommen, sind in [14] zusammengefasst. Zum Großteil haben DNA-Schäden endogene Ursachen, wie Oxidationen durch Sauerstoffradikale, die im Zuge des Stoffwechsels entstehen, Replikationsfehler oder spontane chemische Modifikationen der Basen. Häufig katalysiert das Zellwasser schadhafte Reaktionen:
Die hydrolytische Desaminierung von Adenin zu Hypoxanthin oder von Cytosin zu Uracil bewirkt beispielsweise Basenfehlpaarungen. Auch die hydrolytische Abspaltung ganzer Basen
vom Desoxyriboserest ist möglich (Depurinierung, beziehungsweise Depyrimidinierung).
Die wichtigsten exogenen Ursachen von DNA-Schäden stellen UV-Licht, ionisierende Strahlung und mutagene Substanzen in der Umwelt und unserer Nahrung dar (Abgase, Zigarettenrauch, polyzyklische Kohlenwasserstoffe und Nitrosamine, aber auch erbgutverändernde Viren und Toxine von Bakterien und Pilzen). Zudem gefährdet erhöhte Temperatur die
chemische Stabilität der DNA2. Die Einwirkung von UV-Licht führt vor allem zu PyrimidinDimeren (Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere oder 6-4-Photoprodukte) durch Quervernetzung zweier benachbarter Guanin- oder Thymin-Basen auf demselben DNA-Strang [15]. Auch indirekte Schäden durch Erzeugung von Sauerstoffradikalen sind möglich [16].
Ionisierende Strahlung besitzt ein besonders hohes Schädigungspotenzial, da sie in der
Lage ist, chemische Bindungen zu spalten. Auch hierbei können DNA-Schäden direkt induziert werden, oder indirekt durch Ionisierung anderer Moleküle, die daraufhin mit der DNA
reagieren [17,18]. Dementsprechend groß ist die Vielfalt möglicher Schäden, zu denen Basenmodifikationen, Vernetzungen innerhalb der DNA oder mit Proteinen, sowie Einzel- und
Doppelstrangbrüche zählen [19].
Treten mehrere Schäden in unmittelbarer räumlicher Nähe auf, so werden sie als geclusterte Schäden bezeichnet [20,21]. Je größer die Anzahl der Schäden in einem Cluster ist,
desto höher ist die Komplexität des Clusters. Die Anhäufung vieler Schäden in kurzer Abfolge erschwert die Reparatur, vor allem wenn es sich um viele unterschiedliche oder besonders
schwerwiegende Schäden handelt. Es wird angenommen, dass Schwerionenstrahlung besonders komplexe Schäden verursacht, da die Ionen ihre Energie stoßweise und nur entlang
ihrer Flugbahn abgeben [22] (abgesehen von Sekundärstrahlung, die abseits der Flugbahn
weitere Schäden verursachen kann). Demnach gibt es einen Zusammenhang zwischen dem
Komplexitätsgrad der Schäden und dem LET der Strahlung, der sich in der biologischen
Wirksamkeit niederschlägt [23,24].
1.3.1. DNA-Doppelstrangbrüche
Doppelstrangbrüche (DSBs) stellen eine besonders große Gefahr für die Zelle dar, da sie unmittelbar die Integrität des Genoms verletzen, und weil eine sequenzgenaue Reparatur nur in
bestimmten Situationen möglich ist (siehe Abschnitt 1.5.1). DSBs sind ausschlaggebend für
die zellabtötende Wirkung ionisierender Strahlung und der zentrale Forschungsgegenstand
dieser Arbeit.
2deshalb wird die Therapeutische Hyperthermie zur Unterstützung der Strahlentherapie angewandt.
11
Kapitel 1: Einführung
Ein DSB ist eine bündige oder um einige Nukleotide versetzte Unterbrechung beider Stränge eines DNA-Moleküls. Zu unterscheiden sind zweiendige DSBs, bei denen tatsächlich ein
Bruch innerhalb des Moleküls vorliegt, und einendige DSBs, die ein offenes Ende des Chromatinfadens darstellen. Letztere entstehen in der S-Phase, wenn die Replikationsgabel auf einen
Einzelstrangbruch oder eine Einzelstranglücke trifft [25]. Die Enden der linearen Chromosomen von Eukaryoten gelten in diesem Zusammenhang nicht als einendige DSBs, da sie unter
physiologischen Bedingungen nicht offen liegen; im Menschen bilden sie dank der Telomere
und einer Reihe telomerbindender Proteine eine T-Schleife aus, die sie vor Nuklease-Abbau,
der Erkennung durch DSB-Reparatursysteme3 und Chromosomenfusionen schützt.
Beide DSB-Arten können durch ionisierende Strahlung verursacht werden: zweiendige
DSBs als Primärschäden, die unmittelbar durch die Strahlung induziert werden (in allen
Zellzyklusphasen), und einendige DSBs als Sekundärschäden, die verzögert während der
DNA-Replikation aus Einzelstrangunterbrechungen hervorgehen (auch diese müssen nicht
zwangsläufig direkte Folgen der Strahlung sein, sondern können beispielsweise bei der Reparatur beschädigter Nukleotide durch BER [27] oder NER entstehen).
Einendige und zweiendige DSBs unterscheiden sich nicht nur durch ihre Entstehung voneinander, sie lösen auch verschiedene Signalkaskaden aus (siehe Abschnitt 1.4.1) und können auf verschiedene Weise repariert werden (siehe Abschnitt 1.5.1)
1.4. Die DNA-Schadensantwort
Die Integrität des Genoms ist nicht nur für das Überleben einzelner Zellen von höchster Bedeutung, sondern auch für den Gesamtorganismus, da die Entartung selbst weniger Zellen
aufgrund von Mutationen durch DNA-Schäden zu Krebs führen kann. Im Laufe der Evolution haben sich daher nicht nur vielfältige DNA-Reparaturmechanismen entwickelt, sondern
auch Mechanismen, die irreparabel geschädigte Zellen gezielt eliminieren (programmierter
Zelltod) oder unschädlich machen, indem sie weitere Zellteilungen unterbinden (Seneszenz).
Die Abstimmung dieser Prozesse wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen gewährleistet, das in seiner Gesamtheit als DNA-Schadensantwort bezeichnet wird (für eine
sehr ausführliche Darstellung sei auf [14] verwiesen).
Es reicht von der Schadenserkennung, über temporäre Zellzyklusunterbrechungen, während denen Reparaturversuche unternommen werden, bis hin zu den biologischen Spätfolgen für die Zelle, falls die Reparatur scheitert. Die zeitliche Abstimmung dieser Signalwege
ist entscheidend für das Schicksal der Zelle: Reparaturprozesse greifen sehr schnell, weil sie
durch posttranslationale Modifizierungen kritischer Reparaturproteine ausgelöst werden, die
ständig in der Zelle vorgehalten werden; Spätfolgen setzen verzögert ein, weil sie großteils
auf transkriptionaler Ebene eingeleitet werden. Hierdurch können DNA-Schadenssignale über
längere Zeit integriert werden, so dass die Zelle in der Lage ist, den Reparaturerfolg zu beurteilen und Spätfolgen gegebenenfalls noch abzuwenden.
3dennoch sind Kernkomponenten der DSB-Erkennung (ATM, der MRN-Komplex und die Ku-Proteine, siehe Abschnitt 1.4.1 und 1.5.1) am Aufbau und der Aufrechterhaltung der Telomerstruktur beteiligt. Während einer
kurzen Zeitspanne, in der die T-Schleife nach der Replikation noch nicht wiederhergestellt ist, können diese
Signalproteine Einfluss auf die Telomer-Homöostase nehmen, indem sie wie bei normalen DSBs Zellzyklusblockaden auslösen und der Telomerase erlauben erodierte Telomere wiederherzustellen [26].
12
Kapitel 1: Einführung
1.4.1. Schadenserkennung und Signalverstärkung
DSBs und lange Einzelstrangabschnitte, die vor allem durch blockierte Replikationsgabeln
entstehen, sind gut etablierte Auslöser der DNA-Schadensantwort. Andere DNA-Schäden
können auch repariert werden, ohne eine vollständige Schadensantwort mit Zellzyklusblockaden oder weitergehende Konsequenzen auszulösen, es sei denn sie behindern akut die
Replikation. Dies unterstreicht die besonders große Gefahr für die Genomintegrität, die von
DSBs und Replikationsfehlern ausgeht.
Die Erkennungssignale für Einzelstranglücken und DSBs überlappen in weiten Teilen, sind
aber nicht identisch. Ihre zentralen Komponenten sind die Phosphatidylinositol-3-Kinaseähnlichen Proteinkinasen ATM, ATR und DNA-PK, sowie die Poly-(ADP-Ribose)-Polymerasen
PARP-1 und PARP-2 und der MRN-Komplex. DNA-PK, PARP-1/2 und der MRN-Komplex sind
unmittelbar an der Schadenserkennung und den Reparaturprozessen beteiligt, während ATM
und ATR eher regulatorische Funktionen ausüben und zu den wichtigsten Vermittlern der
weiteren Schadensantwort zählen (siehe Abb. 1.9).
DSBs werden entweder durch DNA-PK oder PARP erkannt. PARP-1 und PARP-2 werden
nicht nur durch Bindung an DSBs, sondern auch an Einzelstrangbrüche und -überhänge aktiviert, für deren Reparatur sie ebenfalls von Bedeutung sind (siehe Abschnitt 1.5.2). Die
Enzyme markieren die Bruchenden, indem sie Poly-(ADP-Ribose)-Ketten an Chromatinproteine (unter anderem H1 und H2B Histone) anheften. Dies erleichtert die Rekrutierung des
MRN-Komplexes [28]. Der MRN-Komplex besteht aus 2 Molekülen Mre11 und jeweils einem Molekül Rad50 und Nibrin (NBS-1). Mre11 besitzt Endo- und Exonuklease-Aktivität,
die für die DSB-Reparatur relevant sind (siehe Abschnitte 1.5.1 und 1.5.1), und eine DNABindefunktion, mit deren Hilfe die Bruchenden eng zusammengehalten werden [29]. Rad50
ist ein Gerüstprotein, das ebenfalls über eine DNA-Bindefunktion verfügt und außerdem
einen langen Seitenarm besitzt, über den sich zwei MRN-Komplexe verhaken können [30].
Vermutlich können hierdurch auch weiter entfernte DSB-Enden beieinandergehalten werden. NBS-1 vermittelt die Rekrutierung von ATM an die Schadstelle. Dies führt zu einer
MRN-abhängigen Autophosphorylierung inaktiver ATM-Dimere, die hierdurch zu aktiven
Monomeren dissoziieren [31,32]. Im weiteren Verlauf der DSB-Reparatur kann es zusätzlich zur Aktivierung von ATR kommen [33] (siehe Abschnitt 1.5.1).
ATR ist der entscheidende Signalgeber bei blockierten Replikationsgabeln. Wenn die Replikation ins Stocken gerät, entkoppelt sich die DNA-Helikase MCM von der DNA-Polymerase
und entwindet weiterhin den Doppelstrang [35]. Es entstehen lange Einzelstrangabschnitte, die zur Stabilisierung von RPA gebunden werden. Die Nukleoprotein-Filamente, die sich
hierdurch ausbilden, rekrutieren ATR über direkte Wechselwirkung mit seinem Bindepartner, dem ATR-interagierenden Protein (ATRIP) [36]. Außerdem fördern sie die Rekrutierung
des 9-1-1 Komplexes, einem Ringklammerprotein aus Rad9, Hus1 und Rad1, das über TopBP1
mit ATR interagiert und dessen Kinaseaktivität hierdurch erheblich verstärkt [37]. Länger
anhaltende Replikationsblockaden führen häufig zu sekundären DSBs unter aktiver Beteiligung von Nukleasen mit anschließender ATM-Aktivierung. In einigen Situationen geschieht
dies offenbar durch DNA-PK und die Nuklease Artemis [25], die sonst bei der Reparatur
von DSBs zusammenwirken (siehe Abschnitt 1.5.1). Glückt die Reparatur, so kann die Replikation wiederaufgenommen werden. ATR kann auch eine DNA-Schadensantwort auslösen,
wenn längere Einzelstrangabschnitte unabhängig von der Replikation entstehen, z.B. im Zuge der Nukleotidexzisionsreparatur [38], die eine besondere Bedeutung für die Reparatur von
13
Kapitel 1: Einführung
UV-Schäden spielt (siehe Abschnitt 1.5.3).
ATM, ATR und DNA-PK phosphorylieren eine Vielzahl verschiedener Proteine, die für die
Schadensantwort wichtig sind und beeinflussen sich gegenseitig durch direkte und indirekte
Interaktionen. Alle 3 Kinasen phosphorylieren das Histon H2AX an Ser139 in unmittelbarer
Nähe des Schadens [39–41]. Diese phosphorylierte Form von H2AX wird als γH2AX bezeichnet und hat große Bedeutung für die Verstärkung von Schadenssignalen, sowie die Bindung
von Reparaturproteinen [42] und Chromatin-modifizierenden Faktoren an den Schadensort
(siehe Abb. 1.9). Die Chromatin-modifizierenden Proteine unterstützen die Reparatur, indem
sie das Chromatin lokal auflockern und damit zugänglicher machen.
H2AX ist eine Histonvariante aus der Familie der H2A Histone, von denen je 2 Vertreter in jedem Nukleosom enthalten sind [43]. Von allen Varianten besitzt nur H2AX die
schadensspezifische Phosphorylierungsstelle. Sie ist Teil eines SQ-Motivs am C-Terminus,
das als Erkennungsstelle für die Kinasen und weitere Interaktionspartner dient. Die H2AXPhosphorylierung breitet sich ausgehend vom Schadensort aus und lässt sich durch Fluoreszenzmarkierung mit spezifischen Antikörpern gut sichtbar machen. Wird die Schadensantwort von DSBs durch Photonenstrahlung ausgelöst, so zeigen sich dabei scharf abgegrenzte
Punkte, die als γH2AX Foci bezeichnet werden und sich bereits wenige Sekunden nach Bestrahlung formieren [44]. Die Foci bilden sich durch eine Kettenreaktion zwischen ATM,
ATR
ATM
DNA(PK
DSB
ATM
44H2AX
NBS(1
Rad50
Mre11 NBS(1
MDC1
Feedback(Schleife
H2AX
PP2A
PP4 Wip1
Reparatur(
proteine
Chromatin(modifi(
zierende4Faktoren
Regulations(4und
Signalproteine
MCM
PARP(1
Replikationsstress
RPA
Nukleosom
Polymerase
KinaseProtein
Enzym
Signalprotein
Helikase Poly(zADP(Riboseg
Phosphatase
Schaden
DNA
Abbildung 1.9. | Schadenserkennung und Signalverstärkung. Die DNA-Schadensantwort wird von
DSBs oder langen Einzelstranglücken ausgelöst. Einzelstranglücken können durch Replikationsstress
entstehen und führen zur Aktivierung von ATR. DSBs werden durch DNA-PK erkannt, oder von PARP1/2 markiert, um den MRN-Komplex zu rekrutieren. ATM, ATR und DNA-PK phosphorylieren H2AX zu
γH2AX, das über eine Kettenreaktion mit NBS-1, MDC1 und ATM/ATR die Schadenssignale amplifiziert und außerdem viele weiterer Proteine an den Schadensort bindet. Quelle: modifiziert nach [34].
14
Kapitel 1: Einführung
γH2AX und dem mediator of DNA damage checkpoint protein 1 (MDC1): Nach der initialen
H2AX-Phosphorylierung durch ATM oder DNA-PK bindet MDC1 an γH2AX, ATM bindet an
MDC1 und phosphoryliert das nächste H2AX-Molekül [45]. Für diese Interaktionen sind zwei
Bindemotive von MDC1 entscheidend: Die BRCA1 C-Terminus (BRCT) Domäne erkennt das
phosphorylierte SQ-Motiv von γH2AX und die forkhead-associated (FHA) Domäne vermittelt
die ATM-Bindung. NBS-1 aus dem MRN-Komplex verfügt ebenfalls über beide Domänen und
kann über beide an MDC1 binden [46]. Dies erleichtert möglicherweise die Rekrutierung der
ersten MDC1-Moleküle unmittelbar an den Bruchenden.
Im Gegensatz zu den diskreten γH2AX Foci führt UV-Bestrahlung zu einer gleichmäßigen diffusen γH2AX-Färbung im gesamten Zellkern (pan-nukleäres γH2AX), die nicht durch
DSBs hervorgerufen wird. Sie kommt in allen Zellzyklusphasen vor, ist aber in der S-Phase
besonders stark [47] und wird durch ATR vermittelt [48], das hierzu mit NBS-1 und MDC1
interagiert [38]. ATR bindet dabei nicht wie ATM an den C-Terminus von NBS-1, sondern
an den N-Terminus, der die BRCT und FHA Domänen enthält. Replikationsbedingt können nach UV-Bestrahlung sekundäre DSBs entstehen, die zusätzlich zu dem pan-nukleären
γH2AX ATM-abhängige Foci hervorrufen [49] (mitunter sind diese schwer erkennbar).
1.4.2. Weiterleitung von Schadenssignalen
Neben Reparaturversuchen leiten ATM und ATR Zellzyklusblockaden ein, indem sie die Kontrollpunkt-Kinasen Chk1 und Chk2 durch Phosphorylierung aktivieren [50,51] (siehe Abb.
1.10). Chk1 und Chk2 phosphorylieren daraufhin die Phosphatasen Cdc25A und Cdc25C.
Dies hemmt die Phosphatasen, führt zum Abbau von Cdc25A durch das Proteasom [52] und
bewirkt den Kernexport von Cdc25C [53]. Die Phosphatasen haben die Aufgabe die Cyclinabhängigen Kinasen (CDKs) zu dephosphorylieren, die zusammen mit ihren Coenzymen, den
Cyclinen die Zellzyklusprogression regulieren. Ohne diese Dephosphorylierung bleiben die
CDKs inaktiv, was im Fall von CDK4/6–Cyclin D und CDK2–Cyclin E zu einem G1-Arrest und
im Fall von CDK2–Cyclin B zu einem G2-Arrest führt. Auch die S-Phase kann in mehreren
Stadien unterbrochen werden.
Bei Replikationsstress aktiviert ATR Chk1, das daraufhin MCM von Cdc45 entkoppelt und
so die Reifung der DNA-Präreplikationskomplexe zu Initiationskomplexen verhindert [54].
Chk1/2, ATM, ATR und DNA-PK phosphorylieren außerdem den Transkriptionsfaktor p53,
der die G1/S-Hemmung unterstützt, indem er die Expression des CDK-Inhibitors p21 fördert [55,56]. Für die Fortsetzung des Zellzyklus nach erfolgreicher Reparatur ist die Dephosphorylierung von γH2AX durch die Proteinphosphatasen PP2A [57], PP4 [58] und Wip1 [59]
erforderlich. Neben vorübergehenden Zellzyklusblockaden kann p21 dauerhafte Seneszenz
vermitteln.
Viele weitere Proteine stehen unter der transkriptionalen Kontrolle von p53; es ist eines der
wichtigsten Regulationselemente an der Schnittstelle zwischen DNA-Reparatur, Zellzykluskontrolle und dem programmierten Zelltod (siehe Abb. 1.11). Die Phosphorylierung von p53
führt zu dessen Stabilisierung und Anhäufung im Zellkern. Die p53-abhängige E3 UbiquitinLigase Mdm2 wirkt dem entgegen, indem sie in einer negativen Rückkopplungsschleife p53
ubiquitiniert und zum Abbau durch das Proteasom freigibt. Wip1 und ATM sind ebenfalls an
diesem Regelkreis beteiligt: ATM hemmt Mdm2 durch Phosphorylierung an Ser395, während
Wip1 dem entgegenwirkt und die Bindung von Mdm2 an p53 fördert [61]. Durch die periodische Aktivierung von p53 wird erreicht, dass sich Schadenssignale erst allmählich in der
15
Kapitel 1: Einführung
G2/MfHemmung
ATRATM
p53 Chk2Chk1
p21
Cdc25A Cdc25C
Chk1
Abbau Kernexport
keine Aktivierung
CDK2‒Cyclin E und
CDK4/6‒Cyclin D
Inhibierung von
CDK2‒Cyclin E
keine Aktivierung
von CDK1‒Cyclin B
G1/SfHemmung
Entkopplung von
MCM und Cdc45
PreRC IC
SfHemmung
DSBs Replikationsstress
Kinase
CDKfInhibitorPhosphatase
Stimulation
Inhibition
Transkriptionsfaktor
Abbildung 1.10. | Einleitung von Zellzyklusblockaden. ATM und ATR vermitteln Zellzyklusblockaden durch Aktivierung der Kontrollpunktkinasen Chk1 und Chk2, sowie p53. Dies führt zur Deaktivierung der Phosphatasen Cdc25A und Cdc25C, die zur Aktivierung der CDKs erforderlich sind. Quelle:
modifiziert nach [60].
Zelle anreichern und Spätfolgen erst eingeleitet werden, wenn die DNA-Reparatur zu lange
dauert [62]. Aufgrund der großen Bedeutung von p53 für die Vermeidung von unkontrollierten Zellteilungen ist das zugehörige Gen TP53 eines der wichtigsten Tumorsuppressorgene.
Es ist in 60% aller menschlichen Tumorerkrankungen verändert und häufig der Grund dafür, dass Krebszellen trotz massiver DNA-Schäden nicht absterben. Bei der hier untersuchten
Glioblastom-Zelllinie U87 MG liegt keine TP53-Mutation vor.
1.4.3. γH2AX als DSB-Marker
Die Entdeckung der DSB-spezifischen γH2AX Foci hat die radiobiologische Forschung beflügelt und zu vielen neuen Erkenntnissen über DNA-Reparaturmechanismen und die räumliche
und zeitliche Regulation der Schadensantwort geführt. Das Auszählen der immunchemisch
markierten Foci unter dem Fluoreszenzmikroskop ist die sensitivste Methode zum DSBNachweis, die bislang zur Verfügung steht. Ihre Anzahl korreliert mit der Menge der DSBs
und steigt zwischen wenigen mGy und einigen Gy Photonenstrahlung linear mit der Dosis [63]. Die anfängliche Annahme dass 1 γH2AX Fokus genau einem DSB entspricht [44,64],
ist jedoch aus heutiger Sicht nicht mehr uneingeschränkt haltbar [34]. Besonders für DSBSchäden durch dicht ionisierende Partikelstrahlung ist diese Hypothese zweifelhaft und das
Zählen der Foci kann schwierig sein, da sich kurz nach Bestrahlung oft linienartige Gebilde
entlang der Partikelflugbahn an Stelle von diskreten Foci zeigen. Die Erfassung solcher qualitativer Eigenheiten ist unverzichtbar für das Verständnis der strahlenspezifischen Wirkung
verschiedener Strahlungsarten. In dieser Arbeit wurde ein automatisiertes Mikroskopiesys16
Kapitel 1: Einführung
p53
DDB1 Polε FEN1 XPC Polβ PCNA
GADD45 PCNA MDM2 p21 Noxa Puma Bax Fas
Zellzyklus Zelltod
DNA-Reparatur
MGMT MSH2
Abbildung 1.11. | Transkriptionales Netzwerk von p53. Auswahl einiger wichtiger Proteine über
die der Transkriptionsfaktor p53 die DNA-Reparatur, die Zellzyklusprogression und den programmierten Zelltod reguliert. Quelle: modifiziert nach [60].
tem eingesetzt, um nicht nur die Anzahl von γH2AX Foci nach Bestrahlung zu bestimmen,
sondern auch die Focigröße, sowie die Intensität der Färbung innerhalb und außerhalb (pannukleär) der Foci objektiv und quantitativ zu erfassen. Hierzu wurde in Zusammenarbeit mit
dem Hersteller des Systems (MetaSystems) die zuvor verfügbare Standardmessung wesentlich erweitert.
Für höhere Dosen ist die Intensität der Immunfärbung ein geeigneteres Maß zur Beurteilung des DSB-Schadens. Sie kann in hohem Durchsatz durchflusszytometrisch gemessen
werden. Für verschiedene Zelllinien (menschliche Krebs- und Normalgewebszellen, sowie
Hamsterzellen) wurde gezeigt, dass die γH2AX-Intensität nach Bestrahlung mit 250 kV Photonen bis weit über 20 Gy linear mit der Dosis steigt [65]. Die meisten Zelllinien zeigten
eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Sättigung der γH2AX-Intensität zwischen 50 und
100 Gy. Die Durchflusszytometrie (FACS) erlaubt außerdem eine multivariate Analyse weiterer Parameter, die für die Strahlenantwort relevant sind [66]. In dieser Arbeit wurde eine
FACS-Methode etabliert, die eine Zellzyklusphasen-spezifische γH2AX-Messung erlaubt und
zusätzlich die Quantifizierung von Apoptose ermöglicht.
Die Betrachtung der γH2AX-Intensität oder Focianzahl im Zeitverlauf ist eine wichtige
Methode zur Beurteilung der DSB-Reparaturkapazität im Vergleich verschiedener Zelllinien
oder Strahlungsarten [67,68]. Bleiben die Werte gegenüber unbestrahlten Kontrollen auch
nach mindestens 24 h noch erhöht, so wird angenommen, dass dies auf irreparable Restschäden hinweist [69]. Neben seinem Nutzen für die Grundlagenforschung hat sich der Nachweis
von γH2AX in den letzten Jahren zu einem wichtigen Werkzeug in vielen Gebieten der angewandten Wissenschaft und Medizin entwickelt [70,71]. Beispiele sind sein Einsatz in klinischen Studien für die Entwicklung neuer Krebsmedikamente [72], sowie in der Biodosimetrie
zur prospektiven und retrospektiven Risikoabschätzung von Strahlungsunfällen [73].
1.5. DNA-Reparatur
Die wichtigsten Reparaturmechanismen werden nachfolgend besprochen. Allen Reparaturmechanismen gemein ist ein hoher Grad an Flexibilität: einige Proteine haben Funktionen
bei mehreren Reparaturmechanismen, doch umgekehrt existieren für die meisten Aufgaben
mehrere redundante Proteine. Scheitert ein bestimmter Reparaturweg, so kann die Repa17
Kapitel 1: Einführung
ratur in manchen Fällen durch einen anderen Mechanismus abgeschlossen werden. Dies
gewährleistet eine effiziente und gleichzeitig robuste DNA-Reparatur. Die beschriebenen Reparaturmechanismen sind daher nicht als unveränderlich zu sehen, sondern als Modell für
einen typischen Ablauf.
1.5.1. DSB-Reparatur
Säugerzellen verwenden hauptsächlich zwei DSB-Reparaturwege: die nicht-homologe Endzu-End-Verknüpfung (NHEJ, engl. non-homologous end joining), und die Reparatur durch homologe Rekombination (HRR, engl. homologous recombination repair). Bei der NHEJ werden
die Bruchenden von fehlerhaften Nukleotiden befreit und direkt miteinander verbunden.
NHEJ führt deshalb grundsätzlich zum Verlust einiger Nukleotide.4 Die Reparatur erfolgt
schnell, ist in allen Zellzyklusphasen möglich und kommt hauptsächlich zum Einsatz um einfache DSBs in Euchromatin zu reparieren. Da die Reparatur das Vorhandensein von zwei
Bruchenden in räumlicher Nähe bedingt, können einendige DSBs nicht durch NHEJ repariert werden. Neben künstlich erzeugten DSBs repariert NHEJ auch die gezielt physiologisch
ausgelösten DSBs im Rahmen der V(D)J Rekombination bei B- und T-Zellen und dem Klassenwechsel bei B-Zellen, wodurch die große Vielfalt der Antikörper und T-Zell-Rezeptoren
erreicht wird [76].
Die HRR nutzt einen homologen Sequenzabschnitt als Matrize, um einen größeren Bereich
um die Bruchstelle durch intakte DNA zu ersetzen. Der Mechanismus entspricht zum Großteil
der homologen Rekombination, die während der Meiose abläuft und dem Austausch von väterlicher und mütterlicher Erbinformation (vertikaler Gentransfer) dient. Im Gegensatz dazu
findet der Sequenzaustausch im Rahmen der DSB-Reparatur normalerweise zwischen dem
beschädigten Doppelstrang und seinem Schwesterchromatid statt; der vertikale Gentransfer
wird unterdrückt. Die Reparatur erfolgt daher im Prinzip fehlerfrei, ist aber in der Regel
auf die späte S- und G2-Phase beschränkt. HRR dauert deutlich länger als NHEJ und wird
mit der Reparatur komplexer DSBs und DSBs im Heterochromatin in Verbindung gebracht.
Außerdem spielt die HRR eine besondere Rolle bei der Reparatur einendiger DSBs.
Nicht-homologe End-zu-End Verbindung
Die Proteine Ku70 und Ku80 bilden ringförmige Heterodimere, die an den Bruchenden die
DNA umklammern und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNAPKcs, engl. DNA-PK catalytic subunit) rekrutieren, so dass der aktive DNA-PK Komplex entsteht [77] (siehe Abb. 1.12). DNA-PK hält die Bruchenden eng zusammen und vermittelt die
Bindung und Aktivierung weiterer NHEJ Komponenten [78]. Autophosphorylierung führt
zur Dissoziation der DNA-PKcs und leitet die weitere Prozessierung der Bruchenden vor der
abschließenden Ligation ein [79]. Eine Bearbeitung der Bruchenden ist nur dann erforderlich, wenn diese nicht kompatibel sind oder beschädigte Nukleotide aufweisen [80]. Die aus
der Einzelstrangbruch-Reparatur bekannte PNK kann beispielsweise chemisch modifizierte
5’-Phosphat und 3’-OH Gruppen der Desoxyribose wiederherstellen; die Nuklease Artemis
4nach Entfernung fehlerhafter Nukleotide können auch neue eingefügt werden, so dass in der Summe Nukleotide hinzukommen [74,75]. Fehlerhafte Nukleotide sind dennoch verloren; nur im Fall bündiger DSBs ohne
Beschädigung der Nukleotide (z.B. durch eine Nuklease) kann die NHEJ zur fehlerfreien Wiederherstellung
der ursprünglichen Sequenz führen (äußerst unwahrscheinlich bei strahleninduzierten DSBs).
18
Kapitel 1: Einführung
kann Nukleotide entfernen und mit Hilfe der Polymerasen µ und λ können Einzelstranglücken aufgefüllt, sowie zusätzliche Nukleotide an den 3’-Enden hinzugefügt werden [75].
Der Ligationskomplex, der schließlich die Bruchenden miteinander verknüpft, enthält DNALigase IV (Lig IV), XRCC4 und dessen Coenzym XLF/Cernunnos. XRCC4–XLF-Multimere bilden hierbei Filamente aus, die sich parallel verlaufend um den DNA-Doppelstrang winden
und die Bruchenden überbrücken [81]. Die Filamente können an die Ku-Proteine binden
und sind möglicherweise schon während der Einleitung der NHEJ von Bedeutung um die
Bruchenden in räumlicher Nähe zu halten.
BindungLderLEnden
ZusammensetzungLderL
funktionalenLDNA-PK
BereinigungLderLEnden
Ku70Ku80
DNA-PKcs
P
PPolλ/μ
Artemis
P
P
PNK
Lig
LIV
XLF XRCC4
LigationNuklease
Polymerase
Kinase
Protein
DNA-Ligase
P Phosphorylierung
Abbildung 1.12. | Nicht-homologe End-zu-End Verbindung. Der DNA-PK-abhängige Mechanismus
zur DSB-Reparatur (D-NHEJ) verläuft in der Regel nicht fehlerfrei, da die Bruchenden nicht ohne
vorherige Bereinigung beschädigter Nukleotide wiederverbunden werden können. Quelle: modifiziert
nach [82].
In Ku/DNA-PK-defizienten Zellen wurde ein alternativer NHEJ-Mechanismus beschrieben,
der über PARP, Histon H1 und DNA-Ligase III (Lig III) vermittelt wird und als Backup-NHEJ
(B-NHEJ) bezeichnet wird [83,84]. B-NHEJ basiert wahrscheinlich auf Mikrohomologien
zwischen den Bruchenden, weshalb manche Autoren auch von microhomology-mediated endjoining (MMEJ) sprechen. Darüber hinaus könnten weitere NHEJ-Varianten existieren, die
ohne Mikrohomologie auskommen, beziehungsweise mit Hilfe von Polymerasen erst welche
einführen [85]. Die alternativen Reparaturwege werden durch den DNA-PK-abhängigen Mechanismus (D-NHEJ) unterdrückt und spielen normalerweise keine große Rolle; sie zeigen
jedoch, wie wandlungsfähig und redundant die DSB-Reparaturmaschinerie ist.
19
Kapitel 1: Einführung
Homologe Rekombination
Der Ablauf der Homologen Rekombination lässt sich in drei aufeinanderfolgende Phasen
einteilen: die Präsynapse, die Synapse und die Postsynapse (siehe Abb. 1.13). Die Präsynapse
beginnt mit einer ausgedehnten Resektion der Bruchenden, wodurch lange 3’-Überhänge entstehen. Zunächst entfernen die Nukleasen Mre11 (aus dem MRN Komplex) und CtIP eine begrenzte Anzahl von Nukleotiden an den 5’-Enden. Hierdurch wird die weitergehende Resektion durch Exonuklease 1 (Exo1) und BLM-Dna2 lizenziert [86]. RPA Proteine binden an die
freigelegten Einzelstrangabschnitte und stabilisieren sie. Die resultierenden NukleoproteinFilamente rekrutieren das ATR-interagierende Protein (ATRIP), wodurch ATR aktiviert werden kann, so dass eine DNA-Schadenssignalkaskade ausgelöst wird, die zum Zellzyklusarrest
führt [36].
Während der Synapse sorgen BRCA1, BRCA2 und Rad52 für den Austausch von RPA mit
Rad51 [88,89]. Dabei handelt es sich um eine DNA-abhängige ATPase, die sowohl doppelATR Resektion
Invasion
BRCAW
BARDWCtIP
Ub CtIP
Ub CtIP
Ub N
R
MN
R
M
BLM
ExoW BLM
ExoWl'lDNA8
ATRIP
BRCAW
BRCA8
PALB8
DNA8
RPA
Rad5W
Rad58
Nuklease
Polymerase
KinaseProtein
Enzym Helikase
Ubiquitinf
ierung
Ub DfSchleife4q
5q 5q 4q 4q 5q 5q 4q Postsynapse
klassische
HRR SDSA BIR
Produktelmitloderl
ohnelStückaustausch keinlStückaustausch keinlStückaustausch
WRN
Mus8W
Rad54
BLM
EmeW
Präsynapse
Synapse
Abbildung 1.13. | Homologe Rekombination. Die Resektion der Bruchenden ermöglicht die Invasion eines Einzelstrangs in den homologen Abschnitt des Schwesterchromatids. Es entsteht eine
D-Schleife, die eine homologiebasierte Neusynthese des verlorenen Sequenzabschnitts erlaubt. Der
klassische Reparaturweg führt zu Produkten mit oder ohne Stückaustausch zwischen den homologen
Chromatiden. Bei der Synthese-abhängigen Stranghybridisierung (SDSA) und der Bruch-induzierten
Replikation (BIR) kommt kein Stückaustausch vor. Quelle: modifiziert nach [82] und [87].
20
Kapitel 1: Einführung
strängige, als auch einzelsträngige DNA binden kann. Zusammen mit Rad52 und der Helikase Rad54 vermittelt Rad51 die Homologiesuche und Invasion des Einzelstrangs eines
Bruchendes in die Doppelhelix der Matrize [90]. Dadurch paart sich der Bruchstrang mit
dem komplementären Strang der Matrize, während der homologe Matrizenstrang verdrängt
wird. Die resultierende Struktur ist eine D-Schleife (engl. displacement loop, kurz D-loop); sie
ermöglicht Leitstrang-DNA-Synthese durch eine Polymerase, wobei das 3’-Ende des beschädigten Chromatids als Primer dient.
In der Postsynapse sind einige alternative Mechanismen möglich, die für den Ausgang der
Reparatur von Bedeutung sind. Im Fall von zweiendigen DSBs kann der Einzelstrang des
zweiten Bruchendes mit dem verdrängten Strang der Matrize gepaart werden (durch direkte Hybridisierung oder Invasion). Dabei entsteht eine doppelte Holliday-Struktur (zweifache
Überkreuzung beider Doppelstränge), die an beiden Bruchenden die Neusynthese fehlender
Abschnitte ermöglicht. Anschließend können die Holliday-Strukturen auf unterschiedliche
Weise aufgelöst werden, die mit oder ohne Stückaustausch5 zwischen den beiden Chromatiden einhergehen. An der Auflösung der Holliday-Strukturen sind die Helikasen BLM und
WRN, sowie die Nukleasen MUS81–EME1, SLX1–SLX4 und GEN1 beteiligt [91]. Die Ligation
verbleibender Einzelstrangbrüche schließt die Reparatur ab. Dieser Reparaturweg stellt die
klassische HRR dar.
Ausgehend von der D-Schleife kann alternativ Synthese-abhängige Stranghybridisierung
(engl. synthesis-dependent strand annealing, kurz SDSA) ablaufen. Dabei löst sich der invasive Bruchstrang wieder von der Matrize, sobald die Neusynthese genügend Überhang
erzeugt hat, dass er mit dem komplementären Strang des zweiten Bruchendes hybridisieren
kann [92]. Verbleibende Einzelstranglücken können dann geschlossen werden, ohne dass es
zur Ausbildung von Holliday-Strukturen kommt; ein Stückaustausch findet daher nicht statt.
Bei der Bruch-induzierten Replikation (BIR) wird die D-Schleife in ein vollständige Replikationsgabel umgewandelt, die den gesamten Sequenzabschnitt der Matrize ab der Bruchstelle
bis zum Ende des Chromatids kopiert [87]. Der Prozess beinhaltet sowohl Leitstrang- als
auch Folgestrang-Synthese. Die Matrize bleibt unverändert (es findet kein Stückaustausch
statt). BIR ist der Hauptmechanismus zur Reparatur einendiger DSBs, sowie zur Auflösung
blockierter oder kollabierter Replikationsgabeln.
Wahl des DSB-Reparaturwegs
In Situationen, die eine DSB-Reparatur sowohl durch NHEJ, als auch HRR erlauben (bei
zweiendigen DSBs in der späten S-Phase und der G2-Phase), hängt die Wahl des Reparaturwegs von der Komplexität der Schadstelle, sowie vom Chromatinkontext ab: Einfache
DSBs im Euchromatin werden vorwiegend schnell (innerhalb von ∼2 h) durch NHEJ repariert, während komplexe DSBs und DSBs im Heterochromatin hauptsächlich über mehrere Stunden hinweg durch HRR repariert werden [93,94]. Die Reparaturgeschwindigkeit
scheint eine wichtige Einflussgröße bei der Wahl des Reparaturwegs zu sein, und es gibt die
Hypothese, dass NHEJ in jedem Fall den ersten Reparaturversuch darstellt. Verläuft die EndVerknüpfung jedoch nicht effizient, so kann sie demnach zu Gunsten von HRR abgebrochen
werden [84,95].
5im Fall von Schwesterchromatiden spricht man von Schwesterchromatidaustausch. Häufig wird allgemein der
Begriff Crossing-over benutzt, obwohl er definitionsgemäß ausschließlich den Austausch zwischen NichtSchwesterchromatiden der homologen Chromosomen bei der Meiose bezeichnet.
21
Kapitel 1: Einführung
Aus regulatorischer Sicht bestimmt das Ausmaß der Bruchenden-Resektion, welcher Reparaturweg eingeschlagen wird [86]. DNA-PK und 53BP1-Rif1 hemmen die Rekrutierung
von Exo1, wodurch die End-Resektion limitiert und NHEJ gefördert wird, während CtIPBRCA1 die Exo1-Rekrutierung fördert und HRR begünstigt [96–98]. Zusätzlich kann der
MRN-Komplex als pro-HRR-Faktor auftreten, indem er über die Mre11-vermittelte NukleaseAktivität die End-Resektion anstößt und den Komplex aus Lig IV, XRCC4 und XLF/Cernunnos
hemmt [29]. Die Ku-Proteine wirken dem entgegen, indem sie mit PARP-1/2 um die Bindung
der Bruchstelle konkurrieren. Sie hemmen dadurch die PARP-vermittelte Markierung der
Bruchenden durch Poly-(ADP-Ribose)-Ketten, von der die Rekrutierung des MRN-Komplexes
abhängt.
Eine wichtige Rolle in diesem regulatorischen Netzwerk kommt außerdem der ATM Kinase zu. Erstens fördert sie die HRR im Heterochromatin indirekt, indem sie das ChromatinUmbau-Protein KAP-1 phosphoryliert [99]. Dies bewirkt eine lokale Auflockerung des Chromatins, die der HRR Maschinerie den Zugang erlaubt. Zweitens trägt die ATM Kinase direkt
zur HRR bei, indem sie CtIP [95] und BRCA1 [100] phosphoryliert. Andererseits phosphoryliert ATM auch 53BP1, wodurch Rif1 rekrutiert wird und zusammen mit 53BP1 BRCA1-CtIP
inhibiert. ATM kann also auch NHEJ fördern und diese Funktion scheint in der G1-Phase
vorzuherrschen, während ab der S-Phase die Unterstützung der HRR überwiegt [96,98].
1.5.2. Basenexzisionsreparatur
Kleinere Basenschäden durch Desaminierung, Alkylierung, Hydrolyse oder Oxidation werden durch Basenexzisionsreparatur (BER) behoben (siehe Abb. 1.14). Verschiedene DNAGlykosylasen prüfen die Basen auf spezifische Schäden, indem sie am DNA-Rückgrat entlangwandern und die Basen einzeln aus der Doppelhelix herausdrehen (engl. base flipping) [101].
Ist eine Base beschädigt, so entfernt sie die DNA-Glykosylase durch Spaltung der N-glykosidischen Bindung mit dem Desoxyriboserest des DNA-Rückgrats.
Zurück bleibt eine AP-Stelle (nach engl. apurinic, beziehungsweise apyrimidinic site), wie
sie auch durch spontane Depurinierung oder Depyrimidinierung entsteht. AP-Endonukleasen
(im Menschen hauptsächlich APE-1) trennen an solchen Basenfehlstellen die Phosphodiesterbindung des DNA-Rückgrats auf.6 Es entsteht ein Einzelstrangbruch mit 3’-OH-Gruppe
und 5’-Desoxyribose-Phosphat-Rest. Durch ionisierende Strahlung verursachte Einzelstrangbrüche weisen häufig andere Restgruppen auf. Diese müssen zunächst durch die Polynukleotidkinase (PNK) bereinigt werden, bevor sie ebenfalls durch die nachfolgenden Schritte
repariert werden können.
Es gibt zwei alternative Wege zum Abschluss der Reparatur [103]. Der vorherrschende
Mechanismus wird als short patch BER bezeichnet: DNA-Polymerase β (Polβ) ersetzt das fehlende Nukleotid basierend auf dem intakten Komplementärstrang und Lig III versiegelt den
verbleibenden Einzelstrangbruch. Beide Enzyme komplexieren dabei mit XRCC1. Im Gegensatz dazu werden bei der long patch BER mehrere Nukleotide ersetzt, wobei neben Polβ auch
die Polymerasen δ und ε im Komplex mit dem Ringklammerprotein proliferating cell nuclear
antigen (PCNA) zum Einsatz kommen. Durch die Neusynthese werden bereits vorhandene
Nukleotide verdrängt. Die Überhänge werden durch flap endonuclease 1 (FEN1) abgeschnitten und die Ligation übernimmt DNA-Ligase I (Lig I).
6Einige DNA-Glykosylasen besitzen Endonuklease-Aktivität und können Nukleotide auch ohne die Hilfe von
AP-Endonukleasen entfernen.
22
Kapitel 1: Einführung
Nuklease
Polymerase
Kinase
Protein
Enzym
DNApLigase
A A C C G T A C T G G C
T T G G C A T G A C C GC
P OH
Einzelstrangbruch(mit(
unsauberen(Enden(X3)pPS(5)pOHR
A A C C G T A C T G G C
T T G G C A T G A C C GC
PNK
POH
A A C C G T A C T G G C
T T G G C T G A C C GC
XRCCI
A A C C G T A C T G G C
T T G G C CA T G A C C G
G
FENI
A A C C G T A C T G G C
T T G G C CA T G A C C G
Abasische(Stelle(durch
spontane(Hydrolyse
A A C C G T A C T G G C
T T G G C CA T G A C C G
OxidationS(AlkylierungS(
Desaminierung
A A C C G T A C
T G
G CT T G G C A TC G
A C
C G
XDNApGykosylase
A A C C G T G G C
T T G G C CA T G A C C G
G CA
FdNTPs Polδ+ε
PC
N
A
A A C C
C
G T A C T G G C
T T G G C A T G A C C G
APEpI
A
C
T
G
G
C
T G
A
C
C
G
A A
C C
G
T T
G G
CA
TG
C
Polβ
A
C
T
G
G
C
T G
A
C
C
G
A A
C C
G
T T
G G
CA
TG
C
FdGTPPolβ
A A C C G T A C T G G C
T T G G C CA T G A C C G
G
Lig(III
short-patch BER
XHauptwegR
A A C C G T A C T G G C
T T G G C CA T G A C C G
G
long-patch BER
XNebenwegR
Lig(I
XRCCI
XRCCI
XRCCI
PARPpI
OHP
A
X
Abbildung 1.14. | Basenexzisionsreparatur. Beschädigte Basen werden durch Basenexzisionsreparatur (BER) korrigiert, wobei entweder nur das beschädigte Nukleotid ersetzt wird (short-patch BER),
oder zusätzlich einige weitere (long-patch BER). Quelle: modifiziert nach [102].
PARP-1 spielt für die Koordinierung der BER und der Schadensantwort der Zelle (auch bei
anderen Reparatursystemen) eine Rolle. Es rekrutiert verschiedene BER-Komponenten und
hängt ihnen und sich selbst in einer NAD+-abhängigen Reaktion Poly-(ADP-Ribose)-Ketten
an, die offenbar für die zeitliche Abfolge der BER von Bedeutung sind und als Energiequelle für den Ligationsschritt dienen [104]. PARP interagiert unter anderem mit APE-1, PNK,
XRCC1 und Polβ.
1.5.3. Nukleotidexzisionsreparatur
Modifizierungen, die zu stärkeren Störungen der DNA-Struktur führen, wie z.B. PyrimidinDimere, werden durch Nukleotidexzisionsreparatur (NER) korrigiert. Die NER hat deshalb
eine besonders große Bedeutung für die Vermeidung von UV-induzierten Mutationen [105].
Einige vererbliche Defekte der NER-Kernkomponenten führen zu schwerwiegenden Krankheitsbildern, die mit erhöhter Lichtempfindlichkeit und vorzeitiger Alterung einhergehen.
Beim Cockayne-Syndrom verursacht ein Defekt in Cockayne Syndrome-A (CSA) oder -B
(CSB) Wachstums- und Entwicklungsstörungen, neuronalen Probleme und Fehlbildungen.
Bei Xeroderma pigmentosum ist eines der 7 Gene für Xeroderma pigmentosum group A-G complementing protein (XPA-XPG) betroffen. In der Folge führt Sonnenlicht bereits nach kurzer
Einwirkung zu irreparablen Hautschäden und es tritt schon in jungen Jahren Hautkrebs auf.
23
Kapitel 1: Einführung
Der Ablauf der NER kann in 4 Schritte unterteilt werden: Fehlererkennung, Fehlerprüfung,
Herausschneiden der Fehlstelle und Neusynthese der entstandenen Einzelstranglücke (siehe
Abb. 1.15). Es gibt zwei verschiedenen Formen der NER, die sich nur bei der Fehlererkennung
unterscheiden: global genome NER (GG-NER) repariert transkriptionell inaktive Stellen im
Genom, während transcription-coupled NER (TC-NER) Schäden während der Transkription
behebt.
Nuklease
Polymerase
Protein
hR23B
XPC
GG-NER TC-NER
5p 5p3p 3p
CSB
PolFII
DDBF1
CSBCSA
XAB2
TFIIH DB
XPG
TFIIH DB
XPG
RPA
XPA
ERCC1
TFIIH DB
XPF XPG
Neusynthese
währendFderF
Transkription
Enzym
Abbildung 1.15. | Nukleotidexzisionsreparatur. Sperrige Einzelstrangschäden werden durch Nukleotidexzisionsreparatur (NER) behoben. Die TC-NER ist an die Transkription gekoppelt, während
die GG-NER genomweit nach Fehlern sucht. Für die folgende Prüfung, Exzision und Neusynthese des
fehlerhaften Abschnitts sind die Xeroderma pigmentosum Proteine (XPA-XPG) von zentraler Bedeutung. Quelle: modifiziert nach [102].
Bei der GG-NER ist der XPC-Komplex für die Fehlererkennung zuständig. Er besteht aus
XPC und UV excision repair protein RAD23 homolog B (hHR23B). XPC ist ubiquitär in der
Zelle vorhanden. Im Zellkern scannt es mit Hilfe seiner Einzelstrang-Affinität die DNA nach
ungepaarten Basen ab. Auf diese Weise erkennt der XPC-Komplex ein breites Spektrum an
DNA-Schäden, die mit kurzen Einzelstrangabschnitten einhergehen und die Konformation
der Doppelhelix stören, z.B. Einzelstrangschleifen, Fehlpaarungsblasen und Einzelstrangüberhänge [106]. Pyrimidin-Dimere werden nicht unmittelbar vom XPC-Komplex erkannt,
sondern vom UV-DDB-Komplex (bestehend aus DNA damage-binding protein 1 und 2, kurz
DDB 1 und DDB 2), der anschließend den XPC-Komplex an die Fehlstelle rekrutiert [107].
Bei der TC-NER kommt die Transkription aufgrund der Schadstelle zum Erliegen. Dies
wird von CSB erkannt, das während der Elongation zusammen mit dem XPG in ständiger
24
Kapitel 1: Einführung
Wechselwirkung mit der RNA-Polymerase II (Pol II) steht. Durch Rekrutierung von CSA und
weiteren Faktoren wie DDB 1 und XPA binding protein-2 (XAB2) wird Pol II von der Schadstelle entfernt um Platz für die Reparaturenzyme zu schaffen [108].
Die nachfolgenden Schritte verlaufen für GG-NER und TC-NER identisch. Bei der Fehlerprüfung wird verifiziert dass es sich um einen NER-spezifischen Schaden handelt oder die
NER wird abgebrochen. Hierbei sind XPA, RPA und TFIIH von zentraler Bedeutung [109].
TFIIH ist ein Transkriptionsfaktor aus mehreren Untereinheiten, der unter anderem die beiden DNA-Helikasen XPB und XPD enthält [110]. Diese entwinden den Doppelstrang in einem Bereich von ∼30 bp um die Schadstelle herum, während RPA den unbeschädigten Einzelstrang stabilisiert und XPA vermutlich den beschädigten Strang auf Deformationen des
Rückgrats untersucht.
Im nächsten Schritt schneiden die beiden Endonukleasen XPG und ERCC1-XPF den Schaden durch zwei Einschnitte aus dem beschädigten Einzelstrang heraus, so dass eine 24 –
32 bp große Lücke entsteht. Die Lücke wird schließlich durch Neusynthese und Ligation von
der regulären DNA-Replikations-Maschinerie wieder geschlossen.
1.5.4. Fehlpaarungsreparatur
Basenfehlpaarungen entstehen vor allem während der DNA-Replikation, wenn die DNAPolymerase Nukleotide auslässt (Deletion), mehrfach kopiert (Insertion) oder nicht-homologe
Nukleotide paart. Zum Schutz vor Basenfehlpaarungen verfügen die Polymerasen δ und ε
über eine Korrekturlesefunktion: sie können fehlgepaarte Nukleotide unmittelbar nach dem
Einbau erkennen und mit Hilfe ihrer 3’→5’ Exonuklease-Aktivität wieder entfernen. Fehlpaarungen, die trotz des Korrekturlesens verbleiben (besonders in hochrepetitiven Sequenzen), können durch Fehlpaarungsreparatur (engl. mismatch repair, kurz MMR) behoben werden. Dabei wird der Umstand genutzt, dass der Sequenzfehler auf dem neu-synthetisierten
Strang liegen muss. In Escherichia coli wird der Elternstrang anhand seiner Methylierung
vom Tochterstrang unterschieden; in letzterem fehlt diese kurze Zeit nach der Synthese
noch [111]. Worauf die Unterscheidung in den meisten anderen Prokaryoten und Eukaryoten
basiert, ist noch nicht genau bekannt. Es wird vermutet, dass in Eukaryoten der Tochterstrang
anhand des offenen 3’-OH-Endes erkannt wird. Hierbei spielt offenbar die Interaktion der
entsprechenden MMR-Proteine mit der Replikationsmaschinerie und insbesondere mit PCNA eine entscheidende Rolle (siehe Abb. 1.16).
Im Menschen sind zwei Heterodimere für das initiale Auffinden der Fehlpaarung verantwortlich: MutSα (bestehend aus MSH2 und MSH6) vermittelt hauptsächlich die Reparatur von Einzelbasen-Fehlpaarungen und kurzen Insertionen/Deletionen (short-patch MMR),
während MutSβ (bestehend aus MSH2 und MSH3) die Reparatur hauptsächlich bei längeren Insertionen/Deletionen (Indels) von bis zu 16 Nukleotiden einleitet. Beide Komplexe
bilden eine Ringstruktur um die DNA herum aus, die es ihnen ermöglicht, an der DNA entlangzuwandern und nach Konformationsfehlern zu suchen. Für MutSα wurde gezeigt, dass
dabei eine helikale Drehbewegung vollzogen wird, bis der Schaden entdeckt ist und MutSα
stoppt [112]. Durch eine ATP-abhängige Konformationsänderung, die mit der Bindung von
MutLα einhergeht, löst sich MutSα wieder von der Schadstelle (jedoch nicht von der DNA).
Hierdurch wandert der MutSα–MutLα-Komplex in einer schnellen diffusiven Gleitbewegung
(ohne helikale Drehung) an der DNA entlang. Warum dies geschieht, ist noch nicht abschließend geklärt. Möglicherweise erlaubt das Lösen von der Schadstelle die Anhäufung mehrerer
25
Kapitel 1: Einführung



Fehlpaarung Elternstrang
Tochterstrang
PCN
A


5ü RCF
PCN
A
PCN
A
Polδ/ε



Exo1
RCF
PCN
A
RPAPCN
A


5ü RCF
PCN
AExo1
PCN
A



MutLα
MLH1 PMS2
RCF
PCN
A
PCN
A



MutSα/β
MSH2 MSH6/3
PCN
A
Nuklease
Polymerase
Protein
Fehlerdetektion
Strangprüfung
Exo1-Rekrutierung
Tochterstrangabbau
Neusynthese
Abbildung 1.16. | Fehlpaarungsreparatur. Für die Reparatur von Basenfehlpaarungen, die während
der Replikation der Korrekturlesefunktion der DNA-Polymerasen entgehen, sind die MutS und MutL
Komplexe verantwortlich. Mit Hilfe von Exo1 und der Replikationsmaschinerie koordinieren sie den
Abbau und die Neusynthese des fehlgepaarten Abschnitts auf dem Tochterstrang. Quelle: modifiziert
nach [102].
MutSα–MutLα-Komplexe in der Nähe des Schadens um die Schadensantwort zu verstärken.
Es ist außerdem denkbar, dass der MutSα–MutLα-Komplex auf diese Weise nach freien 3’OH-Enden zur Strangunterscheidung sucht.
Die nachfolgenden Schritte werden durch MutLα koordiniert. Es ist ein Heterodimer aus
MLH1 und PMS2, das zum Abbau des fehlgepaarten Tochterstrangabschnitts die 5’→3’ Exonuklease Exo1 rekrutiert und selbst über eine latente PMS2-vermittelte Endonukleaseaktivität verfügt [113]. Exo1 benötigt als Startpunkt für den Nukleotidabbau einen Einzelstrangbruch, der gegenüber der Schadstelle in 5’-Richtung gelegen sein muss, damit der fehlgepaarte Abschnitt entfernt werden kann. Befindet sich die Fehlpaarung auf dem Folgestrang,
so kommen prinzipiell die Enden noch nicht ligierter Okazaki-Fragmente als Eintrittsstelle für Exo1 in Betracht (woraus außerdem eine intrinsische Tochterstrangspezifität resultiert). Rekonstitutionsexperimente mit aufgereinigten MMR-Proteinen haben gezeigt, dass
nur MutSα, Exo1 und RPA erforderlich sind, um den fehlgepaarten Abschnitt abzubauen,
wenn bereits ein 5’-gelegener Einzelstrangbruch existiert [114] Ist dies nicht der Fall, so sind
außerdem MutLα, PCNA und replication factor C (RFC) erforderlich: RFC belädt die DNA mit
PCNA und PCNA aktiviert die Endonuklease-Aktivität von MutLα, die dann durch einen 5’
des Schadens gelegenen Einschnitt eine Startstelle für den Exo1-Abbau erzeugt [115]. Da
26
Kapitel 1: Einführung
PCNA die DNA auf gerichtete Weise umklammert und direkt mit dem MutS–MutL-Komplex
(sowie mit Exo1) interagiert, könnte PCNA der entscheidende Faktor für die Tochterstrangspezifität in diesem Szenario sein (und erklären, warum MutS–MutL die Fehlstelle verlässt).
Nach Abbau der fehlgepaarten Sequenz inhibieren MutLα und RPA Exo1 und verhindern
damit eine übermäßige Hydrolyse. Schließlich erfolgt die Neusynthese und des fehlenden
Abschnitts durch die normale Replikationsmaschinerie.
Während der MMR wird der Einbau der Nukleosomen in das Chromatin verzögert, da
dies die Reparaturproteine behindern würde. Hierzu interagieren PCNA und MutSα mit
dem chromatin assembly factor 1 (CAF-1). Darüber hinaus spielen einige MMR-Komponenten
auch bei weiteren zellulären Prozessen eine Rolle, die im Zusammenhang mit anderen DNAReparatursystemen stehen. MutSα hemmt beispielsweise die Rekombination bei unvollkommener Sequenzhomologie [116] und trägt zur Hypervariabilität von Antikörpern bei, indem
es (vermutlich mit Hilfe von Exo1 und DNA-Polymerase η) die Mutationsrate in den variablen
Bereichen der Immunglobulin-Gene erhöht [117,118]. Außerdem fördert MutLγ (ein Heterodimer aus den MutL-Homologen MLH1 und MLH3) die Bildung von Crossover-Produkten
bei der Rekombination während der Meiose [119].
1.5.5. Weitere Reparaturmechanismen
Einige DNA-Schäden können direkt durch spezialisierte Reparaturproteine behoben werden.
Hierzu zählt die 6-O-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) [120]. Sie macht die 6O-Methylierung von Guanin innerhalb der DNA rückgängig, indem sie die Methylgruppe
auf einen eigenen Cystein-Rest überträgt. Ein Austausch der Base durch BER ist somit nicht
notwendig. Die Reaktion ist stöchiometrisch, da das Protein dabei seine Aktivität verliert.
Ein weiteres Beispiel für direkte DNA-Reparatur stellt die Korrekturlesefunktion einiger
DNA-Polymerasen dar, die bereits im Rahmen der Fehlpaarungsreparatur besprochen wurde.
Darüber hinaus verfügen viele Organismen aus allen Domänen des Lebens über Photolyasen,
die im Stande sind Pyrimidin-Dimere ohne die Hilfe von NER aufzulösen [121]. Sie spalten
die Quervernetzung durch eine Reduktion der Basen, die an die Oxidation von FADH2 zu
FAD gekoppelt ist (Photoreaktivierung). Die Energie für diese Reaktion beziehen die Photolyasen durch Absorption von blauem oder UV-Licht mit ihrem Antennenkomplex. Trotz dieser
eleganten Lösung, bei der die Schadensursache gleichzeitig für die Reparatur genutzt wird,
sind nur wenige höhere Säugetiere bekannt, die über funktionsfähige Photolyasen verfügen [122]. Auch im Menschen sind sie nicht aktiv. Der Grund für den Verlust der Photolyasen
während der Evolution ist umstritten.
1.5.6. Fehlertoleranz
Neben den regulären DNA-Polymerasen, die während der Replikation zum Einsatz kommen,
gibt es eine Reihe spezieller DNA-Polymerasen, die in der Lage sind, die DNA-Synthese trotz
vorhandener Basenschäden fortzusetzen (translesion synthesis, kurz TLS). Zu ihnen gehören
die Polymerasen η , ι , κ, Rev1, sowie ζ und die aus der BER bekannte Polβ [123]. Sie besitzen
keine Korrekturlesefunktion und zeichnen sich durch ein besonders großes und gut zugängliches aktives Zentrum der Polymeraseaktivität aus. Hierdurch ist eine flexiblere Basenpaarung
möglich und selbst sperrige DNA-Addukte können als Matrize genutzt werden. Verschiedene TLS-Polymerasen weisen dabei unterschiedliche Spezifitäten für bestimmte Modifizierun27
Kapitel 1: Einführung
gen auf: Polymerase η kann beispielsweise relativ fehlerfrei Pyrimidin-Dimere für die DNASynthese nutzen. Auch das Überspringen beschädigter Nukleotide ist möglich; insbesondere
können AP-Stellen von Polβ ausgelassen werden, wenn keine rechtzeitige Reparatur durch
BER erfolgt ist [124]. Manche Schäden können den aufeinander folgenden Einsatz mehrerer
TLS-Polymerasen erfordern. Die Polymerasen ζ und κ dienen vermutlich vor allem der Verlängerung des Tochterstrangs nach Einsatz des Nukleotids gegenüber der Fehlstelle auf dem
Elternstrang durch eine fehlerspezifische TLS-Polymerase [125].
TLS ist ein Notfallmechanismus zur vorübergehenden Toleranz von DNA-Schäden während der Replikation, der allein dem Überleben der Zelle dient. Er kann den Zusammenbruch der Replikationsgabel und Folgeschäden wie Translokationen verhindern, steht jedoch
in Konkurrenz mit DNA-Reparaturmechanismen, ist relativ fehleranfällig und wirkt daher
oft mutagen. Deshalb ist eine strenge Regulation der TLS-Polymerasen wichtig. Nach dem
polymerase-switching Modell führt die Blockade der Replikationsgabel durch einen DNASchaden zur Monoubiquitinierung von PCNA durch ein Heterodimer aus Rad18 und der
E2 Ubiquitin-Ligase Rad6. Dies bewirkt die Dissoziation der replikativen DNA-Polymerase im
Austausch gegen eine TLS-Polymerase. Nach Überwindung der Fehlstelle wird PCNA wieder deubiquitiniert und der Polymerasetausch rückgängig gemacht, so dass die Aktivität der
TLS-Polymerasen auf die Replikations-blockierende Schadstelle begrenzt bleibt [126,127].
Ein alternativer Fehlertoleranzmechanismus, bei dem die Replikation prinzipiell fehlerfrei
verläuft, ist der Matrizenwechsel (engl. template switch). Hierbei pausiert die blockierte (reguläre) Polymerase auf dem einen Elternstrang, während der andere Strang weiter repliziert
wird. Letzterer wird anschließend von der blockierten Polymerase verwendet, um die DNASynthese fortzuführen. Der Matrizenwechsel geht mit einer Polyubiquitinierung von PCNA
einher und verwendet neben eigenen Faktoren auch Enzyme aus der Homologen Rekombination [128]. Wie bei der HRR, basiert der Matrizenwechsel auf Stranginvasion und der
Ausbildung und Wiederauflösung von doppelten Holliday-Strukturen [129].
1.6. Biologische Spätfolgen von DNA-Schäden
Können DNA-Schäden über einen längeren Zeitraum nicht repariert werden, so führen die
anhaltenden DNA-Schadenssignale in gesunden Zellen zur Aufgabe der Zellteilung (Seneszenz) oder zum programmierten Zelltod. Dies dient zum Schutz des Organismus vor Mutationen und der Entstehung von Krebs. Der Transkriptionsfaktor p53 ist hierbei als Tumorsuppressor von prominenter Bedeutung.
1.6.1. Apoptose
Die Apoptose ist eine Form des programmierten Zelltods, der sich im Gegensatz zur Nekrose durch einen geregelten Abbau der Zellbestandteile auszeichnet, ohne dass diese sich
frei in den extrazellulären Raum ergießen. Morphologisch geht sie mit Zellschrumpfung,
Chromatin-Kondensation, dem Verlust der Adhäsion und dem „Blasenwerfen“ der Plasmamembran (membrane blebbing) einher. Die Integrität der Zelle wird dabei so lange wie möglich aufrechterhalten, bis schließlich die DNA in Fragmente spezifischer Länge zerschnitten
wird, das Zytoskelett abgebaut wird, und die Zelle in einzelne membranumschlossene Vesikel
(apoptotische Körperchen) zerfällt. Dies verhindert eine unkontrollierte Freisetzung des Zell28
Kapitel 1: Einführung
inhalts, der auf Nachbarzellen toxisch wirkt und Entzündungen auslösen kann. Die apoptotischen Körperchen werden anschließend von Makrophagen und/oder benachbarten Zellen
über Phagozytose aufgenommen und verdaut. Auf diese Weise können die Grundbausteine
der enthaltenen Biomoleküle wiederverwendet werden.
Die Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus zur schonenden Entfernung von Zellen, die
zu schwer beschädigt sind, um sich zu reparieren und eine potenzielle Gefahr für den Organismus darstellen. Daneben ist die Apoptose für eine Reihe weiterer physiologischer Prozesse
von großer Bedeutung: während der Entwicklung ermöglicht sie das gezielte Entfernen von
Zellen zur Gestaltung der Organe und der Körperform [130], sie gewährleistet die Plastizität
des zentralen Nervensystems, bewirkt die Selektion von B- und T-Zellen des Immunsystems
und reguliert die Zellzahl in Geweben um die Homöostase aufrechtzuerhalten.
Apoptose kann entweder von externen Signalstoffen ausgelöst werden, die an spezielle Todesrezeptoren in der Plasmamembran binden (extrinsische Apoptose, Typ I), oder von
Stress-vermittelten Signalen innerhalb der Zelle (intrinsische Apoptose) über das Mitochondrium (Typ II) oder das Endoplasmatische Retikulum (Typ III). Alle Wege führen in der Regel
zur Aktivierung von Caspasen (engl. cysteinyl-aspartate specific protease), einer Familie von
Proteinkinasen, die ihre Zielproteine C-terminal von einem Aspartat-Rest zerschneiden (siehe Abb. 1.17). Caspasen sind die Hauptakteure der Apoptose und unterscheiden diese von
anderen Formen des programmierten Zelltods. Es gibt Initiator-Caspasen (Caspase-2, -8,-9,
-10, -11 und -12), Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6 und -7) und inflammatorische Caspasen
(Casp-1, -4 und -5), die eine besondere Rolle bei der Reifung von T-Zellen spielen. In der
Zelle liegen die Caspasen in ihrer inaktiven Form, als Pro-Caspasen, vor. Ihre Aktivierung
geschieht durch gezielte proteolytische Spaltung und Zusammenlagerung der Spaltprodukte
zum aktiven Enzym. Hierbei kommt es zu einer Aktivierungskaskade, in der zunächst andere
Faktoren die Initiator-Caspasen aktivieren, die wiederum die Effektor-Caspasen aktivieren.
Letztere aktivieren weitere Effektor-Caspasen, andere Proteasen, wie Calpaine und Cathepsine, den Chromatin-Kondensationsfaktor Acinus und die Caspase-aktivierte DNase (CAD). Außerdem spalten die Effektor-Caspasen Proteine wie PARP, MDC1 [131], Actin und Lamin. All
dies führt schließlich zum Abbau des Zytoskeletts und der DNA, begleitet von den typischen
morphologischen Merkmalen der Apoptose.
Extrinsische Apoptose-Induktion
Bei der extrinsischen Apoptose oligomerisieren die Todesrezeptoren (Fas, TNF-R, DR3, DR4
und DR5) nach Bindung ihrer Liganden. Dies bewirkt die Rekrutierung von Adapterproteinen, die zur Aktivierung von Caspase-8 führt (im Fall von Fas oder DR4/5 kann auch
Caspase-10 aktiviert werden). Beispielsweise sorgt die Bindung von Fas antigen ligand (FasL)
für die Bildung von Fas-Trimeren, wodurch eine intrazelluläre Domäne entsteht, an die das
Fas-associated death domain protein (FADD) bindet und Pro-Caspase-8 rekrutiert. Hierdurch
entsteht der death-inducing signaling complex (DISC), der zur Aktivierung von Caspase-8
durch Dimerisierung und Autoproteolyse führt [132].
Intrinsische Apoptose-Induktion
Die intrinsische Apoptose des Typs II kann von einer Vielzahl verschiedener Stressfaktoren
mit exo- oder endogener Ursache ausgelöst werden, allen voran DNA-Schäden und oxidati29
Kapitel 1: Einführung
APOofLM
TWEAK
DRf
APOof
APOonLM
TRAIL
DRyMG
RIP
TRADD
TRADD FADD
FADD CaspoZmoäh
FasL
FasM
CDwG
RIPASKä
Daxx
FADD
CaspoZmoäh
TNFoα
TNFoRä
TRADD
TRAFn RIPä
cIAPäMn
FADD RIPä
CaspoZ
Caspo6
ER7Stress
[Canu]
Bclon
BcloxL
BID
Bax
Bad Puma
Noxa
Bak
tBID
Bak
Bax
Bax
pGf
Bclon
Bax
Bax
ATMMATR
ChkäMn
DNAoSchäden
Apafoä
Cyto7c
AIF Endo7G
Caspow
ApoptosomCaspof
Calpain
Caspoän
Caspow
DFFA
CADLamin7A Actin
Acinus
PARP
Caspoi
Zytoplasma
Zellkern
Zytoplasma
Blasenwerfen
der7Membran
Schrumpfung
Chromatino
kondensation
Acinus CAD
Endo7G
AIF
DNAoFrago
mentation
Kinase
Protein
Caspase
Enzym
Stimulation
Inhibition
tendenziell7fördernd
tendenziell7hemmend
Translokation
Stimulation7Bmehrere7Schrittel
transkriptionelle7Stimulationantiapoptotisch
proapoptotisch
Transkriptionsfaktor
Abbildung 1.17. | Apoptose. Der programmierte Zelltod durch Apoptose wird entweder durch Rezeptoren in der Plasmamembran vermittelt (Typ I), oder durch intrinsische Faktoren, die Prozesse im
Mitochondrium (Typ II) oder dem Endoplasmatischen Retikulum (Typ III) in Gang setzen. In der Folge werden Caspasen aktiviert, die das Zytoskelett abbauen und weitere Enzymen aktivieren, die das
Chromatin kondensieren und die DNA fragmentieren. Quelle: Cell Signaling Technology (modifiziert).
ver Stress. Hierbei spielen die Proteine der Bcl-2 Familie eine wesentliche Rolle. Sie kommen
in der äußeren Mitochondrienmembran vor und integrieren sowohl pro- als auch antiapoptotische Signale. Bcl-2 und Bcl-xL zählen zu den wichtigsten antiapoptotischen Komponenten,
während Bad, Bid, Bak, Bax, Noxa und Puma die Apoptose fördern. Bax ist ein Cofaktor von
p53, das als Transkriptionsfaktor die Expression von Bax, Puma und Noxa verstärkt. Durch
Interaktion mit Puma erfährt zytoplasmatisches Bax eine Konformationsänderung und wird
in die äußere Mitochondrienmembran inkorporiert. Dort binden vermutlich mehrere Bax
Proteine aneinander und bilden Poren, durch die unter anderem Cytochrom c (Cyto c) aus
dem Mitochondrium austritt. Ab diesem Schritt kann die Apoptose nicht mehr aufgehalten
30
Kapitel 1: Einführung
werden: Cytochrom c verbindet sich im Zytosol mit dem apoptotic protease-activating factor
1 (Apaf-1), das daraufhin eine ATP-abhängige Konformationsänderung erfährt und zu einer
Ringstruktur oligomerisiert. Durch Bindung und Aktivierung mehrerer Pro-Caspase-9 Moleküle reift diese Plattform zum Apoptosom. Dieses ist in der Lage große Mengen an Caspase-3
und weiteren Effektorcaspasen zu aktivieren. Daneben kann die Freisetzung von Apoptosisinducing factor 1 (AIF) und Endonuklease G (Endo G) aus dem Mitochondrium zu untypischen
Verläufen der Apoptose ohne Aktivierung von Caspasen führen.
Die Typ III Apoptose ist noch am wenigsten erforscht. Sie stellt eine Stressreaktion des
Endoplasmatischen Retikulums (ER) dar und kann durch Glucosemangel, eine Störung des
Ca2+-Haushalts, Hypoxie und fehlgefaltete Proteine ausgelöst werden. Diese Form der Apoptose ist in Nervenzellen von besonderer Bedeutung und spielt bei einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Chorea Huntington eine
Rolle [133]. ER-Stress kann zur Ausschüttung großer Mengen von Ca2+-Ionen ins Zytosol
führen. Wie bei der Mitochondrien-vermittelten Apoptose sind dabei die Bcl-Proteine Bax
und Bak involviert [134]. In der Folge aktiviert die Calcium-abhängige Cysteinprotease Calpain Caspase-12, durch die Caspase-9 und schließlich die Effektor-Caspasen aktiviert werden [135,136]. Daneben wurde in embryonalen Mausfibroblasten ein alternativer Weg nachgewiesen, bei dem p53 die Transkription von Puma und Noxa verstärkt und den mitochondrialen Weg der Apoptose mit Ausbildung des Apoptosoms in Gang setzt [137].
Es gibt auch eine Verbindung zwischen Typ I und Typ II Apoptose: In manchen Zellen
reicht die Todesrezeptor-vermittelte Aktivierung von Caspase-8 nicht aus, um die EffektorCaspasen in ausreichendem Maß für den Abschluss der Apoptose zu aktivieren. In diesem
Fall kann Caspase-8 Bid zu truncated Bid (tBid) zerschneiden, das Bcl-xL inhibiert und die
mitochondriale Apoptose einleitet.
Künstliche Apoptose-Induktion
Es gibt eine Reihe künstlicher Substanzen, die zur gezielten Induktion der Apoptose im Rahmen der Krebstherapie verwendet werden. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Substanzen
für experimentelle Zwecke verwendet: SuperKillerTRAIL und MG132. SuperKillerTRAIL ist
ein besonders potenter Ligand der Todesrezeptoren DR4 und DR5, der den extrinsischen
Weg der Apoptose auslöst. Es handelt sich um ein in Escherichia coli rekombinant hergestelltes Peptid, das die extrazelluläre Domäne des humanen Tumornekrosefaktor-verwandten
Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) enthält. Durch eine künstlich eingefügte Mutation
stabilisiert eine zusätzliche Cystin-Brücke die Zusammenlagerung der TRAIL-Rezeptoren zu
ihrer aktiven, multimeren Form.
MG132 ist ein kleines modifiziertes Peptid, das die Plasmamembran eukaryotischer Zellen
überwinden kann und als starker, reversibler Proteasom-Inhibitor wirkt. Es reduziert die Degradierung ubiquitinierter Proteine und leitet den ER-Stress-vermittelten intrinsischen Weg
der Apoptose (Typ III) ein.
1.6.2. Autophagozytose
Eine andere Form des programmierten Zelltods kann die Autophagozytose darstellen. Unter
physiologischen Bedingungen ist die Autophagozytose ein Recyclingsystem der Zelle, das zur
Erneuerung verschiedener Zellbestandteile dient, einschließlich ganzer Zellorganellen [138].
31
Kapitel 1: Einführung
In einem Vesikel-basierten Prozess werden alte Zellkomponenten abgebaut und als Bausteine
für neue Biomoleküle wiederverwendet [139]. Die Autophagozytose beseitigt damit beschädigte und potenziell gefährliche Stoffe und gewährleistet die dauerhafte Funktionsfähigkeit
der Zelle. Dies ist vor allem in den langlebigen Nervenzellen von großer Bedeutung [140].
Bei Nährstoffmangel hilft die Autophagozytose der Zelle ihren Energiebedarf zu vermindern
und „gesundzuschrumpfen“. Daneben können durch Autophagozytose auch Fremdstoffe in
der Zelle, bis hin zu Viren und Bakterien abgebaut werden. Diesen Zellüberlebens-fördernden
Aufgaben der Autophagozytose steht ihre Rolle bei der Beseitigung nicht zu rettender Zellen
zum Wohl des Gesamtorganismus gegenüber [141].
Es werden 3 Mechanismen unterschieden: Makro-, Mikro- und Chaperon-vermittelte Autophagozytose. Bei der Chaperon-vermittelten Variante befördert Hsc70 Proteine mit einem
spezifischen Erkennungsmotiv mit Hilfe des lysosome-associate membrane protein 2A (LAMP2A) zur Verdauung in das Innere eines Lysosoms [142]. Bei der Mikroautophagozytose
umschließt das Lysosom direkt das zu verdauende Material innerhalb des Zytosols [143].
Größere Zellkomponenten werden über den Hauptweg, die Makroautophagozytose, abgebaut [144]. Im Rahmen dieser Arbeit ist nur dieser Weg von Bedeutung und wird im Folgenden synonym mit dem allgemeinen Begriff „Autophagozytose“ verwendet.
Die Makroautophagozytose ist durch Ausbildung des Autophagosoms charakterisiert, einem Doppelmembran-Vesikel, das aus einer offenen Isolationsmembran hervorgeht (siehe
Abb. 1.18). Die Isolationsmembran (auch Phagophore genannt) entstammt vermutlich dem
ER. Sie umschließt die abzubauende Struktur und reift dadurch zum Autophagosom. Dieses verschmilzt anschließend mit einem Lysosom zum Autolysosom (vorher kann es noch
mit Endosomen verschmelzen). Die innere Membran zerfällt, so dass ihr Inhalt mit den
lysosomalen Verdauungsenzymen in Kontakt kommt und abgebaut wird. Die Kernkomponenten für die Bildung des Autophagosoms sind die Atg-Proteine [145]. Sie lassen sich in
mehrere funktionale Einheiten einteilen, die für verschiedene Schritte der AutophagosomReifung erforderlich sind: für die Keimung der Isolationsmembran sind der ULK1- und der
PI3K-Komplex wichtig; für ihre Erweiterung um die abzubauende Struktur herum sorgt das
Atg12-Konjugationssystem, und die Schließung des Autophagosoms wird durch das LC3Konjugationssystem vermittelt.
Der ULK1-Komplex enthält die namensgebenden Unc-51-like kinase 1 (auch Atg1 genannt),
Atg13 und das Gerüstprotein FIP200. Der Komplex ist eine wichtige Regulationsschnittstelle für die Autophagozytose: er wird von der Serin/Threonin-Proteinkinase mTOR gehemmt, und durch die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) gefördert [146]. Über mTOR
werden der PI3K-I / Akt Signalweg, der MAPK / Erk1/2 Signalweg und p53-vermittelte DNASchadenssignale integriert. AMPK erkennt Defizite im Energiehaushalt der Zelle anhand des
AMP/ATP-Verhältnisses und fördert die Autophagozytose durch Aktivierung von ULK1 und
Hemmung von mTOR. Der PI3K-Komplex enthält die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K type
3), ihr Adapterprotein p150, sowie Atg14 und Beclin-1. Letzteres ist mit Bcl-2 verwandt und
interagiert mit diesem, wodurch Bcl-2 nicht nur die Apoptose, sondern auch die Autophagozytose hemmt. Beclin-1 trägt zur Entscheidung zwischen Apoptose und Autophagozytose bei,
indem es selbst antiapoptotisch wirkt und gleichzeitig ein Zielprotein für den proteolytischen
Abbau durch Caspasen darstellt [147].
Das Atg12-Konjugationssystem setzt sich aus Atg5, Atg7, Atg10, Atg12 und Atg16L1 zusammen. Es bildet ein Atg5–Atg12–Atg16L1-Homodimer, das an der äußeren Schicht der
32
Kapitel 1: Einführung
Inhibition
Protein
Verbindung
antiapoptotisch
Stimulation
Kinase
PRASäk
Rubicon
BclZD
LCGZII
SQSTM +pOD
ALFY
NBR AtgwAtg OL
Atg OL
Atg k
AtgU
Atg D
Atgw
AtgG
AtgU
LCGZI
LCG
Atgä
PE
ZytoplasmaZ
inhalt
7 7
Einschluss
Autophagosom
Lysosom
Fusion
Lysosom
AutoZ
lysosom
IsolationsZ
membran
Apoptose
p wk
MembranZ
keimung
PIGK
type3III
BeclinZ
Atg ä
Atg D
LA
M
P
LA
M
PD
pwG3+3DNAZ3
Schadenssignale
Atg G
GβL
AMP
ATP
AminoZ
säuren
PIGK3+3Akt
Signalweg
MAPK3+3Erk +D
Signalweg
AMPK mTOR
FIPDkk
ULK
Raptor
Abbildung 1.18. | Makroautophagozytose. Regulation und Reifung des Autophagosoms bis zur Verschmelzung mit einem Lysosom zum Autolysosom, in dem die abzubauenden Substanzen schließlich
verdaut werden. Quelle: Cell Signaling Technology (modifiziert).
Isolationsmembran lokalisiert ist und während der Schließung zum Autophagosom wieder von dieser dissoziiert. Der Atg12-Komplex ist essentiell für die Lipid-Modifizierung von
microtubule-associated protein light chain 3 (LC3), die zur Schließung des Autophagosoms
führt. [148]. Nach posttranslationaler Modifizierung von LC3 durch die Cystein-Protease
Atg14 entsteht zunächst die zytosolische Form LC3-I. Sie wird von Atg3 und Atg7 durch
Anheftung von Phosphatidylethanolamin (PE) in die Autophagosom-assoziierte Form LC3II konvertiert. Diese Konvertierung ist ein spezifischer Marker für die Autophagozytose und
kann (wie hier) mit Hilfe von Western Blots nachgewiesen werden: trotz der höheren molaren Masse migriert LC3-II aufgrund des Lipids während der Gelelektrophorese schneller
(16 kDa scheinbare Masse) als LC3-I (18 kDa scheinbare Masse), so dass sich bei aktiver
Apoptose eine Doppelbande zeigt.
1.6.3. Seneszenz
Wenn Zellen ihre Teilungsfähigkeit verlieren ohne abzusterben, gehen sie in Seneszenz [149].
Dies betrifft unter physiologischen Bedingungen alle vollständig ausdifferenzierten Körperzellen. In vitro zeigt sich außerdem, dass Primärzellen seneszent werden, sobald sie ihre,
im Allgemeinen durch die Telomerlänge vorgegebene, maximale Anzahl an Zellteilungen
33
Kapitel 1: Einführung
überschreiten. Daneben können pathogene Einflüsse wie DNA-Schäden zur vorzeitigen Seneszenz führen. Die Zellen steigen über den p53-p21 Signalweg während der G1-Phase aus
dem Zellzyklus aus und begeben sich in die G0-Phase.
Manche Autoren bezeichnen den Eintritt in die G0-Phase als einen besonders lang anhaltenden Zellzyklusarrest; tatsächlich unterscheiden sich G0-Zellen jedoch in ihrer Morphologie, Stoffwechselaktivität und Genexpression von normalen, vorübergehend ruhenden oder
kontaktinhibierten G1-Zellen: G0-Zellen sind unter anderem größer (erhöhtes Zytoplasmavolumen im Vergleich zum Zellkern) [150], weisen eine erhöhte Aktivität der β -Galactosidase
auf [151] und exprimieren nicht den Proliferationsmarker Ki-67 [152]. Außerdem schützt
der Eintritt in die G0-Phase die Zellen vor dem programmierten Zelltod, ganz im Gegensatz
zum Arrest in den Zellzyklusphasen, der mit fortschreitender Dauer den zellulären Selbstmord fördert. Neuere Studien weisen darauf hin, dass neben dem klassischen Eintritt in die
Seneszenz aus der G1-Phase heraus auch G2-Zellen seneszent werden können [153].
1.7. Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie
In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Fluoreszenzmikroskop verwendet, das zwei superauflösende Mikroskopietechniken in einem Gerät vereint [154]. Die Auflösung eines Mikroskops
ist ein Maß dafür, wie detailreich es feine Strukturen abbilden kann. Umgekehrt betrachtet,
gibt die Auflösung an, wie klein die Unterschiede zwischen den Bestandteilen eines Objekts
minimal sein dürfen, damit sie sich in der optischen Abbildung noch voneinander trennen
lassen. Es gibt verschiedene Kriterien, nach denen sich diese Grenze angeben lässt, und oft
hängt es von der Problemstellung ab, welches Kriterium am wichtigsten ist (siehe Übersichtsartikel [155]). Beispielsweise kann die Größe oder die Form eines einzelnen Objekts
von Interesse sein, oder aber die Anzahl und Konformation der Objekte, aus denen sich eine
größere Struktur zusammensetzt. Im einen Fall ist es wichtig zu wissen, wie groß das Objekt mindestens sein muss, damit es maßstabsgerecht abgebildet werden kann; im anderen
Fall ist es wichtiger den minimalen Abstand zu kennen, den zwei Objekte mindestens haben
müssen, damit sie voneinander unterschieden werden können.
Das historisch erste und nach wie vor gebräuchlichste Kriterium der optischen Auflösung
in der Bildebene (lateral) hat Ernst Abbe im Jahr 1873 definiert [156]. Das Abbe-Kriterium
(1.3) gibt den minimalen Abstand an, den die Linien eines optischen Gitters aufweisen müssen, damit sie getrennt voneinander abgebildet werden können. Für den Spezialfall selbstleuchtender Objekte, die bei der Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz kommen, ist außerdem das Rayleigh-Kriterium (1.4) von Bedeutung.
dAbbe ≥
λ0
2 NA
, NA = n sinα dAbbe Kleinster Objektabstand nach Abbe
λ0 Wellenlänge des betrachteten Lichts
im Vakuum
NA Numerische Apertur des Objektivs
n Brechungsindex
α Objektseitiger Öffnungswinkel
des Objektivs
(1.3)
dRayleigh ≥
0,61 λ0
NA
dRayleigh Kleinster Objektabstand nach Rayleigh (1.4)
34
Kapitel 1: Einführung
In der Praxis ergeben sich nach Abbe und Rayleigh ähnliche Werte, wonach konventionelle
Mikroskope im besten Fall Strukturen auflösen können, die nicht kleiner sind als die halbe
Wellenlänge des von ihnen ausgehenden Lichts. In der optischen Mikroskopie kommen Wellenlängen unterhalb von 400 nm nicht vor, da kurzwelligeres Licht außerhalb des sichtbaren
Spektrums liegt, von konventionellen Linsen kaum oder gar nicht transmittiert wird und keine geeigneten Fluorophore zur Verfügung stehen. Deshalb liegt die laterale Auflösungsgrenze
konventioneller Mikroskope bestenfalls bei ∼200 nm.
Die große Bedeutung des Abbe-Kriteriums liegt darin, dass es eine fundamentale Grenze
für die Leistungsfähigkeit eines optischen Systems angibt, die sich mit Hilfe der geometrischen Optik nicht erklären lässt. Abbe war der Erste, der erkannte, dass die Beugung des
Lichts dafür verantwortlich ist, dass sich die Struktur eines Objekts nicht beliebig genau abbilden lässt (Beugungsgrenze). Tritt eine Lichtwelle durch das Linsensystem eines Mikroskops,
so erfährt sie eine Apertur, die sowohl durch die Wellenlänge des Lichts, als auch durch die
Eigenschaften der Linsen bestimmt ist (in der Praxis spielt außerdem der Brechungsindex der
Probe und des Mediums zwischen Probe und Objektiv eine Rolle). Aus einem punktförmigen
Lichtsignal entsteht in der Bildebene ein verschmierter Lichtfleck, der von Beugungsringen
umgeben ist.
Das 3-dimensionale Beugungsmuster eines punktförmigen Objekts wird Punktbildfunktion
oder Punktspreizfunktion (engl. point spread function, kurz PSF) genannt. Die PSF ist charakteristisch für die Abbildungseigenschaften und somit das Auflösungsvermögen eines optischen Systems. Das Gesamtbild entsteht durch Faltung des vom Objekt ausgehenden Lichts
mit der PSF (siehe Abb. 1.19); es kommt also zur Überlagerung eng benachbarter Lichtsignale und außerdem existiert eine Mindestgröße der abgebildeten Lichtflecke, die unabhängig
von der tatsächlichen Objektgröße nicht unterschritten werden kann. Für Objekte, die kleiner sind als die Auflösung, können deshalb weder Aussagen über die genaue Größe, noch
über ihre Form getroffen werden.
Objekt PSF Bild
Distanz (Pixel)
Gr au w er t Distanz (Pixel) Distanz (Pixel)
Gr au w er t Gr au w er t Abbildung 1.19. | PSF und mikroskopische Abbildung. Ein mikroskopisches Bild entsteht durch
Faltung des betrachteten Objekts (hier ein Siemensstern) mit der Punktbildfunktion (PSF) des optischen Systems. Dies bewirkt eine Unschärfe der Objektstrukturen und begrenzt die Auflösung. Feine
Objektdetails gehen verloren, wie auch die Grauwertprofile von links nach rechts entlang der roten
Linie zeigen.
35
Kapitel 1: Einführung
Aufgrund seines fundamentalen Charakters, galt das Abbe-Kriterium über ein Jahrhundert lang als unüberwindbar. Erst in den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich gezeigt,
dass es Möglichkeiten gibt, das Abbe-Kriterium zu umgehen (ohne es zu brechen!). Mittlerweile existieren verschiedene Techniken, die dies bewältigen. Sie werden unter dem Begriff
superauflösende Mikroskopie zusammengefasst, oder auch superauflösende Fluoreszenzmikroskopie, da es sich im Wesentlichen um Fluoreszenztechniken handelt. Für eine ausführliche
Abhandlung über die Entstehungsgeschichte der superauflösenden Mikroskopie sei auf [155]
verwiesen.
Alle superauflösenden Mikroskopietechniken beruhen auf der Schaffung besonderer Beobachtungsbedingungen, für die das Abbe-Kriterium nur eingeschränkt zutrifft. Wie Abbe
selbst bereits in seiner Veröffentlichung bemerkte, gilt sein Theorem nämlich nur unter ganz
speziellen Voraussetzungen (die lange für unabänderlich gehalten wurden), und zwar der
Weitfeldmikroskopie mit homogener Beleuchtung ohne spektral und/oder zeitlich getrennte
Detektion verschiedener Objektbestandteile. Folglich gibt es einige prinzipiell verschiedene
Strategien, bei denen superauflösende Mikroskopietechniken ansetzen:
• Minimierung des effektiven Beleuchtungsquerschnitts, beziehungsweise -volumens auf
Ausmaße unterhalb der Auflösungsgrenze (Verkleinerung der effektiven PSF)
• spektral und/oder zeitlich getrennte Detektion einzelner Fluoreszenzmoleküle zu ihrer
genauen Lokalisierung unter Ausnutzung der Form der PSF zur Schwerpunktbestimmung (Lokalisationsmikroskopie)
• Erweiterung des abbildbaren Informationsgehalts durch geeignete Modulation der Beleuchtung
Grundsätzlich können Fernfeld- und Nahfeld-Methoden unterschieden werden (siehe Tab.
1.1). Nahfeldmikroskope machen sich durch einen sehr geringen Arbeitsabstand die besonderen Eigenschaften der PSF in unmittelbarer Nähe der Flouorphore zu Nutze. Sie eignen
sich nur für die Betrachtung von Oberflächen und rastern diese mit sehr feinen Sonden ab.
Fernfeldmikroskope haben größere Arbeitsabstände und erfassen entweder einen großen
Bildausschnitt auf einmal (Weitfeldmikroskopie) oder rastern das Präparat ebenfalls Punkt
für Punkt ab (wie im Fall des Konfokalmikroskops, das jedoch nicht zu den superauflösenden
Techniken zählt).
Tabelle 1.1. | Superauflösende Mikroskopietechniken. Einteilung der wichtigsten Technologien
nach dem Prinzip der Auflösungsverbesserung.
Prinzip der Auflösungsverbesserung
Verkleinerung
der eff. PSF
EinzelmolekülLokalisierung
Beleuchtungsmodulation
Fernfeld — GSDIM
PALM/FPALM
SPDM/SPDMPhymod
STORM/dSTORM
SIM
SMI
STED/CW-STED
Nahfeld SNOM/NSOM — —
Beide hier verwendeten Techniken sind Weitfeldmethoden. Es handelt sich um spectral precision distance microscopy with physically modifiable fluorochromes (SPDMPhymod), eine Varian36
Kapitel 1: Einführung
te der Lokalisationsmikroskopie, und structured illumination microscopy (SIM), eine Technik,
die auf der Erweiterung des abbildbaren Informationsgehalts durch strukturierte Beleuchtung beruht.
1.7.1. Lokalisationsmikroskopie (SPDMPhymod)
SPDMPhymod nutzt ein nicht-lineares Fluoreszenzphänomen aus, um einzelne Fluorophore
zeitlich getrennt voneinander zu detektieren [157–159]. Die Probe wird mit Laserlicht hoher
Intensität beleuchtet, so dass die Fluorophore innerhalb kurzer Zeit ausbleichen. Im Gegensatz zu dem unerwünschten Bleicheffekt bei konventioneller Fluoreszenzmikroskopie, kehrt
jedoch ein Teil der Fluorophore stochastisch nach einem Zeitraum zwischen einigen Sekunden und mehreren Minuten in den fluoreszierenden Zustand zurück (reversibles Bleichen).
Sie erscheinen dann kurz als helle Lichtpunkte (einer direkten Abbildung der PSF) im sonst
dunklen Blickfeld, bevor sie erneut ausbleichen. Hierfür ist eine geeignete photochemische
Umgebung in der Probe notwendig. Das photochemische Prinzip hinter diesem Blinkphänomen ist noch weitgehend unverstanden; es tritt jedoch bei vielen Fluorophoren auf und
hängt sowohl von der chemischen Natur des Fluorophors, als auch des Eindeckmediums
ab (für einige Fluorophorgruppen wurden bereits verschiedene Mechanismen vorgeschlagen [160–162]).
Die stochastische Natur des Blinkens führt zu einer zeitlichen Trennung der Einzelmolekülsignale und somit auch zu ihrer optischen Isolierung. Mit Hilfe von Gauß-Fits (oder
anderen Näherungen an die PSF) kann so die Position der einzelnen Fluorophore bis auf
wenige Nanometer genau bestimmt werden, selbst wenn ihre räumliche Distanz weit unterhalb der Auflösungsgrenze liegt (wir erreichen typischerweise Lokalisationsgenauigkeiten
von 10 – 20 nm, abhängig vom Signal-zu-Rausch-Verhältnis). Das Blinken der Fluorophore
wird durch die Aufnahme vieler Bilder in kurzer Abfolge verfolgt (wir erstellen typischerweise 1000 – 2000 Bilder im Abstand von 50 – 100 ms). Aus der gewonnenen Positionsinformation kann schließlich ein hochaufgelöstes Bild rekonstruiert werden, wobei verschiedene
Visualisierungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen [163].
Im einfachsten Fall werden die Signalpositionen als helle Pixel in ein Bild eingetragen. Um
die Unsicherheit der Positionsbestimmung zu berücksichtigen, kann die Intensität dieser Pixel im Radius der Lokalisationsgenauigkeit Gauß-förmig verschmiert werden. Aufwändigere
Visualisierungsmethoden versuchen anstelle der einzelnen Signalpositionen, die Signaldichte wiederzugeben. Hierdurch entsteht ein natürlicheres Bild, weil Intensitätsunterschiede auf
ähnliche Weise gewichtet werden wie bei konventioneller Weitfeldmikroskopie. Eine solche
Methode ist die hier verwendete Triangulations-Visualisierung: Das Bild wird durch Verbinden von Tripletts benachbarter Signalpositionen zu Dreiecken gerendert. Die jedem Dreieck
zugewiesene Intensität ist invers proportional zu seiner Fläche, und repräsentiert somit die
lokale Signaldichte. Das Bild wird anschließend geglättet, indem die Triangulation viele male
(hier 100 – 1000x) mit zufällig veränderten Signalpositionen wiederholt und mit dem vorherigen Bild überlagert wird. Die Signalpositionen werden dabei nur innerhalb eines vorgegebenen Radius verändert, der wiederum von der lokalen Signaldichte abhängt (hier wurde
die mittlere Distanz zu den nächsten 4 Nachbarsignalen verwendet).
Der große Vorteil der Lokalisationsmikroskopie liegt nicht allein in der starken Verbesserung der Auflösung, sondern auch in der Verfügbarkeit der Positionsinformation. Diese
kann zur Analyse von Signaldistanzen und Nachbarschaftsbeziehungen genutzt werden, um
37
Kapitel 1: Einführung
beispielsweise die Bildung von Proteinclustern wie Rezeptoren und Ionenkanäle zu untersuchen. Eine Besonderheit des hier angewandten SPDMPhymod Verfahrens im Vergleich zu
anderen Varianten der Lokalisationsmikroskopie liegt darin, dass sowohl in vitro, als auch
in silico die Mehrfachdetektion individueller Fluorophore möglichst vermieden wird. Dazu
werden Eindeckmedien und Beleuchtungsintensitäten verwendet, die mehrfaches Blinken
hemmen. Zudem werden geeignete Filter-Algorithmen angewandt um eventuelle Mehrfachdetektionen desselben Moleküls aufgrund von langanhaltenden (ggf. „flackernden“) Fluoreszenzereignissen über mehrere Einzelbildaufnahmen hinweg (Multiframe-Signale) zu berücksichtigen. Methoden wie dSTORM begünstigen explizit eine möglichst häufige Detektion der
Fluorophore [164]. Das erhöht zwar die Signalausbeute, hat aber den Nachteil, dass es zu
Problemen bei quantitativen Analysen kommen kann.
1.7.2. Strukturierte Beleuchtung
Bei der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung wird die Probe nicht homogen ausgeleuchtet, sondern mit einem periodisch modulierten Intensitätsmuster [165–167]. Meist (wie
auch hier) handelt es sich um ein Streifenmuster mit sinusförmig schwankender Helligkeit,
das durch Interferenz zweier kohärenter Laserstrahlen erzeugt wird [168]. Um zu verstehen,
wie eine solche Beleuchtungsform zur Verbesserung der Auflösung beiträgt, ist es hilfreich,
die optische Abbildung eines Objekts im Frequenzraum zu betrachten [165]. Mit Hilfe der
Fourier-Transformation lässt sich jedes Objektdetail im Ortsraum als Summe von harmonischen Funktionen mit unterschiedlichen Ortsfrequenzen beschreiben. Je höher die Frequenz
ist, desto feiner sind die Objektdetails, die sie repräsentieren.
Nach dieser Betrachtungsweise lässt sich die optische Abbildung als Übertragung eines
frequenzmodulierten Signals auffassen, bei dem das Mikroskop als Hochpassfilter wirkt. Wie
stark die verschiedenen Ortsfrequenzen zur Informationsübertragung beitragen, wird durch
die optische Übertragungsfunktion (engl. optical transfer function, kurz OTF) beschrieben:
sie entspricht der Fourier-Transformation der PSF. Die Grenzfrequenz, bei der die OTF ihren
Nullpunkt erreicht, entspricht der Auflösung nach Abbe (man bemerke die Analogie zwischen
dem minimal darstellbaren Gitterabstand und der maximal übertragbaren Gitterfrequenz).
Durch Überlagerung der strukturierten Beleuchtung mit dem Objekt entsteht ein MoiréMuster [169], ähnlich wie bei der Überlagerung zweier leicht gegeneinander verdrehter Gitter oder zweier Gitter mit leicht verschiedenem Gitterabstand (siehe Abb. 1.20). Die Gitterfrequenz des Moiré-Musters ist kleiner als die Frequenz beider Muster, aus denen es entsteht.
Durch diesen Effekt ist die strukturierte Beleuchtung in der Lage, Ortsfrequenzen jenseits
der Grenzfrequenz in das übertragbare Frequenzband der OTF zu verschieben (siehe Abb.
a b
Abbildung 1.20. | Moiré-Effekt. Bei der Überlagerung zweier leicht gegeneinander verdrehter Gitter
(a) oder zweier Gitter mit leicht verschiedenem Gitterabstand (b) entsteht ein neues Streifenmuster
mit kleinerer Gitterfrequenz (Moiré-Muster).
38
Kapitel 1: Einführung
1.21). Die Auflösung lässt sich hierdurch in jeder Raumrichtung verdoppeln [169], wenn die
Gitterfrequenz des Beleuchtungsmusters der Grenzfrequenz der OTF entspricht (zur Verbesserung der axialen Auflösung kann durch 3-Strahl-Interferenz ein Intensitätsmuster erzeugt
werden, das auch entlang der optischen Achse moduliert ist [170]). Zusätzlich wird der
Kontrast erhöht, da Frequenzen nahe der Grenzfrequenz stärker gewichtet werden als ohne
strukturierte Beleuchtung. Dieser Aspekt ist oft von größerer Bedeutung für den nutzbaren
Informationsgehalt des mikroskopischen Bilds als die Auflösungsverbesserung selbst.
a b c d
Abbildung 1.21. | SIM-Prinzip. Das sinusförmige Beleuchtungsmuster (a) enthält 3 Spitzen im Frequenzraum (b), der als Polardarstellung abgebildet ist und den winkelabhängigen Informationsgehalt
des Objekts bei radial von der Mitte aus wachsender Frequenz zeigt. Die Spitze in der Mitte entspricht
der 0. Ordnung der Gitterfrequenz (0 Hz), die beiden äußeren entsprechen der 1. Ordnung. Der blaue
Umriss steht für die Grenzfrequenz der OTF. Durch Verschiebung des Beleuchtungsgitters über das
Objekt hinweg lässt sich dank des Moiré-Effekts die Grenzfrequenz entlang der Bewegungsrichtung
erweitern (c), bis hin zu einer Verdopplung der übertragbaren Bandbreite. Um eine isotrope Auflösungsverbesserung zu erhalten, muss das Gitter außerdem gedreht werden (d). Quelle: modifiziert
nach [168].
Um lateral eine isotrope Auflösung zu erzielen, muss das Beleuchtungsgitter in gleichen
Winkelabständen gedreht werden (üblicherweise werden 3 Rotationswinkel im Abstand von
60° gewählt). Außerdem muss das Gitter durch Modulation der Phase über das Objekt
gescannt werden. Bei mindestens 3 Phasenpositionen und 3 Rotationswinkeln müssen für
ein Bild also mindestens 9 Aufnahmen gemacht werden. Für ein 3D-Bild muss diese Sequenz
für jede Position entlang der optischen Achse wiederholt werden. Aus den Einzelbildern
kann anschließend ein hochaufgelöstes Bild erzeugt werden. Dazu ist allerdings ein aufwändiges Rekonstruktionsverfahren nötig [171,172], bei dem zunächst die einzelnen Komponenten (Ordnungen) des Moiré-Musters voneinander getrennt werden, um dann die Objektfrequenzen zu isolieren, an ihren ursprünglichen Platz im Frequenzband zurückzuschieben
und schließlich zu einem einzelnen Spektrum zusammenzufügen.
39
2 MATERIALIEN UNDSTANDARDMETHODEN
2.1. Allgemeine Laborgeräte
Gerät Bezeichnung Hersteller
Analysenwaage TE124S Sartorius
Feinwaage Scout Pro Ohaus
Glasgeräte, div. Volumina Bechergläser, Messzylinder, ... SCHOTT
Kolbenhubpipetten, div. Volumina Eppendorf Research/Reference Eppendorf
Kolbenhubpipetten, div. Volumina PIPETMAN Classic Gilson
Kühlzentrifuge Omnifuge 2.0 RS Heraeus Sepatech
Magnetrührer mit Heizung MR Hei-Standard Heidolph
Mikrozentrifuge, ungekühlt Heraeus Pico 21 Thermo Scientific
Mikrozentrifuge, gekühlt Heraeus Fresco 17 Thermo Scientific
pH-Elektrode mit Temperatursensor SE100 N Knick
pH-Messgerät pH-Meter 766 Calimatic Knick
Pipettierhilfe PIPETBOY acu INTEGRA Biosciences
Taumler (Plattformschüttler) Polymax 1040 Heidolph
Vortex-Mixer Vortex-Genie 2 neoLab Migge
2.2. Zellkultur
2.2.1. Geräte
Gerät Bezeichnung Hersteller
Brutschrank Forma Steri-Cycle CO2 Thermo Scientific
Einfriergefäß Nalgene „Mr. Frosty“ Thermo Scientific
Inverses Mikroskop CK2 Olympus
Kolbenhubpipetten, div. Volumina RAININ LTS Classic Mettler-Toledo
Kühlzentrifuge Omnifuge 2.0 RS Heraeus Sepatech
Neubauer-Zählkammer Neubauer Improved BRAND
Sicherheitswerkbank (Klasse II) SterilGARD The Baker Company
Pipettierhilfe PIPETBOY acu INTEGRA Biosciences
Wasserbad mit Temperaturkontrolle M20 LAUDA
40
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
2.2.2. Medien
Bezeichnung Bezugsquelle Art.-Nr.
DMEM mit stabilem Glutamin Biochrom FG 0415
PBS (nach Dulbecco), ohne Ca und Mg PAA H15-002
EMEM mit stabilem Glutamin Biochrom FG 0325
Fötales Kälberserum, standardisiert Biochrom S 0615
Natriumpyruvat, 100 mM Biochrom L 0473
Nicht-essentielle Aminosäuren, 100x Konzentrat Biochrom K 0293
Penicillin/Streptomycin, 100x Konzentrat Biochrom A 2213
2.2.3. Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung Bezugsquelle Art.-Nr.
5-Objektträger-Boxen Sigma-Aldrich HS 15 986
6-Well-Platten BD Falcon 353 046
Kryoröhrchen, 2mL Greiner Bio-One 122 277
Pipettenspitzen, 20µL Mettler-Toledo RT-L10F
Pipettenspitzen, 200µL Mettler-Toledo RT-L200F
Pipettenspitzen, 300µL Mettler-Toledo RT-L300F
Pipettenspitzen, 1 mL Mettler-Toledo RT-L1000F
Quadripermschalen Greiner Bio-One 96 077 307
Röhrchen, 15 mL BD Falcon 352 096
Röhrchen, 50 mL BD Falcon 352 098
Serologische Pipetten, 2 mL BD Falcon 357 507
Serologische Pipetten, 5 mL BD Falcon 357 543
Serologische Pipetten, 10 mL BD Falcon 357 551
Serologische Pipetten, 25 mL BD Falcon 357 525
T25 Zellkulturflaschen Greiner Bio-One 690 175
T75 Zellkulturflaschen Greiner Bio-One 658 175
T175 Zellkulturflaschen Greiner Bio-One 660 175
2.2.4. Zellen
Alle Hauptversuche wurden mit der Glioblastom-Zelllinie U87 (ATCC, Art.-Nr.: HTB-14)
durchgeführt. Die Zellen stammen aus einem Grad IV Astrozytom einer 44-jährigen Frau
[173]. Die Zelllinie zählt zu den am häufigsten untersuchten Gehirntumorzellen und hat besonders große Bedeutung für klinische Studien in Tiermodellen. Der p53-Status der Zellen
ist normal. Das U87-Genom wurde 2010 vollständig sequenziert [174]. In vitro wachsen die
Zellen adhärent mit epithelialer Morphologie und stellen bei Konfluenz das Wachstum ein.
41
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Für einige Vorversuche zur Methodenoptimierung wurden neben U87 auch MRC-5 Zellen (ATCC, Art.-Nr.: CCL-171) verwendet. Es handelt sich dabei um primäre Fibroblasten
aus physiologisch normalem Lungengewebe eines 14-wöchigen, männlichen Fötus [175].
Die Morphologie der Zellen ist epithelial. Sie wachsen adhärent und zeigen bei Konfluenz
Kontaktinhibition.
2.2.5. Kultivierung von U87 Zellen
U87 Zellen wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) mit 10% standardisiertem fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert. Kryokonservierte U87 Zellen wurden in einem
Wasserbad bei 37°C erwärmt. Sobald ∼90% der Suspension aufgetaut war, wurden die Zellen in eine T75-Flasche mit 15 mL vorgewärmtem Medium überführt und über Nacht (ÜN)
im Brutschrank bei 37°C in einer dampfgesättigten Atmosphäre mit 6% CO2 inkubiert. Am
folgenden Tag wurde das Medium durch 15 mL frisches Medium ersetzt, um das Dimethylsulfoxid (DMSO) aus dem Einfriermedium zu entfernen.
Routinemäßig wurden die Zellen alle 3 Tage nach der Aussaat im Verhältnis 1:5 passagiert, wobei beim Wechsel der Flaschengröße der geänderten Wachstumsfläche Rechnung
getragen wurde. Dieser Rhythmus garantierte das gleichmäßige Wachstum der Kultur, ohne Überschreiten von 60 – 80% Konfluenz. Alle erforderlichen Lösungen wurden auf 37°C
vorgewärmt, um Zellstress durch Temperaturgradienten zu vermeiden (die Zellen reagieren empfindlich auf Hitzeschocks und können sich vom Flaschenboden lösen, wenn man
sie in kaltem Medium in den Brutschrank stellt). Nach Entfernen des Mediums wurden die
Zellen mit PBS gespült, 10 – 20 s mit Trypsin-EDTA-Lösung inkubiert. Restliche adhärente
Zellen wurden durch leichtes Abklopfen der Flaschen gelöst und das Trypsin wurde durch
Zugabe des 4-fachen Volumens an frischem Medium gestoppt. Die Zellsuspension wurde in
frische Kulturflaschen verteilt, mit Medium auf das Zielvolumen aufgefüllt (5/15/25 mL bei
T25-/T75-/T175-Flaschen) und im Brutschrank inkubiert.
Zu Beginn dieser Doktorarbeit wurde eine U87 Zellbank in Form von Kryokonserven erstellt, die als Grundlage für alle Experimente dienten. Hierzu wurden 76·106 Zellen aus
8 T175-Flaschen geerntet, in 50 mL Einfriermedium (Vollmedium mit 10% DMSO) aufgenommen und in 1 mL Portionen zu je ∼1,5·106 Zellen auf 43 Kryoröhrchen verteilt. Die
Zellen wurden bei einer Abkühlgeschwindigkeit von 1°C·min–1 ÜN in einem Kryogefäß auf
–80°C gekühlt, in eine Kunststoffbox überführt und in der Dampfphase eines elektronisch
geregelten Flüssig-Stickstoff-Tanks bei ca. –175°C gelagert. Während der Zellkultur wurden
regelmäßig Kontaminationskontrollen (Multiplex-PCR) durch eine DKFZ-interne Dienstleistungseinheit durchgeführt [176].
2.2.6. Wachstumskurve U87
Zur Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit der U87 Zellen unter den verwendeten Kulturbedingungen, wurden je 5·105 Zellen in T75-Flaschen ausgesät und die Zellzahl wurde
täglich durch Auszählen mit der Neubauerkammer unter dem Mikroskop bestimmt. Abbildung 2.1 zeigt die Ergebnisse. Nach einer anfänglichen Lag-Phase wuchs die Zellzahl exponentiell (Log-Phase) mit einer Wachstumsgeschwindigkeit von 0,0219 h–1, bzw. einer Verdopplungszeit von 32 h. Ab einer Zellzahl von etwa 9·106 trat Kontaktinhibition ein und
die Zellen gingen in die stationäre Phase über. Die Konfluenz wurde bei ∼10·106 Zellen
42
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
erreicht. Zur Vermeidung von Kontaktinhibition wurden die Zellen bei maximal 80% der
Konfluenz passagiert. Dies entsprach einer Zellzahl von 2,7·106 in T25-Flaschen, 8,0·106 in
T75-Flaschen und 18,7·106 in T175-Flaschen.
105
106
107
0 24 48 72 96 120 144 168
Zeit_Uh)
Ze llz
ah l Log-PhaseLag-Phase
stat.
Phase
N=N0·100,0219·h
_1
Wachstumskurve_U87
a 24 h 48 h
72 h 96 h
200 µm
b Abbildung 2.1. | Wachstum von U87 Zellen. (a) Wachstumskurve (Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellzahl und exponentieller Fit der Log-Phase). (b) Phasenkontrastbilder der Zellen im
Zeitverlauf.
2.2.7. Kultivierung von MRC-5 Zellen
MRC-5 Zellen wurden in Eagle’s Minimal Essential Medium (EMEM) mit 10% FCS, 1 mM
Natriumpyruvat und 1x Nicht-essentiellen Aminosäuren kultiviert (alle Angaben sind Endkonzentrationen). Abweichend von der Vorgehensweise bei U87 wurden kryokonservierte
MRC-5 Zellen nach dem Auftauen nicht direkt ausgesät, sondern zunächst in 10 mL Medium
aufgenommen und 5 min bei 125x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, um
die Zellen von dem Einfriermedium zu befreien. Das Zellpellet wurde in 15 mL frischem Medium resuspendiert und in eine T75-Flasche überführt, die anschließend unter den gleichen
Bedingungen im Brutschrank inkubiert wurde, wie bei U87. Die Subkultur erfolgte analog
zur Prozedur bei U87, ebenfalls alle 3 Tage und im Verhältnis 1:5.
2.3. Bestrahlung
Für Bestrahlungsexperimente kamen je nach Zielsetzung verschiedene Strahlenquellen und
experimentelle Anordnungen zum Einsatz. Für die Durchflusszytometrie wurden Zellen in
T25-Flaschen bestrahlt, für Proteinanalysen (Western Blot) wurden T75-Flaschen benutzt
und für rein mikroskopische Untersuchungen wurden Zellen auf Objektträgern (OT) oder
Deckgläsern (DG) verwendet.
Experimente mit Photonenstrahlung wurden am DKFZ durchgeführt. Für die Hauptversuche kam ein Linearbeschleuniger (LinAc) ARTISTE (Siemens) zum Einsatz, mit dem auch
Patienten behandelt werden. Vorversuche zur Methodenentwicklung wurden mit einer 60Co
γ-Strahlenquelle (Gammatron, Siemens) durchgeführt. Bestrahlungen mit 12C-Ionen erfolgten hauptsächlich am Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum (HIT) der Uniklinik.
43
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
a b c Abbildung 2.2. | Bestrahlungsanordnungen. (a) LinAc: Bestrahlung von oben, durch 30 mm wasseräquivalentes Aufbaumaterial über der Isoebene (Zellebene). Vorversuche wurden auf ähnliche Weise
am Gammatron durchgeführt, jedoch ohne Aufbaumaterial (nicht abgebildet). (b) HIT: Bestrahlung
von der Seite, durch 30 mm wasseräquivalentes Material (Range shifter) vor der Isoebene (Zellebene).
(c) SNAKE: Schrägbestrahlung, Zellebene ∼7° gegenüber der Strahlrichtung verkippt.
44
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Tabelle 2.1. | Kenngrößen der eingesetzten Strahlenquellen. Der lineare Energietransfer (LET)
bezieht sich auf die wasseräquivalente Absorption in der Zellebene gemäß den Versuchsanordnungen
in Abb. 2.2. Er entspricht bei HIT-Bestrahlung dem Mittelwert der im spread-out Bragg-Peak (SOBP)
überlagerten Teilchen mit unterschiedlichen Energien und bei SNAKE-Bestrahlung dem Wert im monoenergetischen Bragg-Peak.
Strahlenart Strahlführung LET
keV·µm–1
Gammatron Photonen, 1,25 MeV homogenes Bestrahlungsfeld ∼0,3
LinAc Photonen, 6 MeV homogenes Bestrahlungsfeld ∼0,3
HIT beschleunigte 12C6+-Ionen,
1,2 – 2,4 GeV (100 – 200 MeV·u–1)
Rasterscan-Verfahren, 8 mm
SOBP
∼120
SNAKE beschleunigte 12C6+-Ionen, 35 MeV
(2,92 MeV·u–1)
Rasterscan-Verfahren,
monoenergetisch
∼450
Einige Experimente mit 12C-Ionen-Strahlung wurden außerdem an der experimentellen
Ionenstrahl-Anlage SNAKE (Supraleitendes Nanoskop für Angewandte Kernphysikalische Experimente) der Technischen Universität München durchgeführt. Abbildung 2.2 zeigt den jeweils verwendeten experimentellen Aufbau und in Tabelle 2.1 sind die physikalischen Kenngrößen der unterschiedlichen Strahlenquellen gegenübergestellt.
Für alle Experimente, die dem direkten Vergleich der Wirkung von Photonen- und 12CIonen-Strahlung dienten, wurden die Bestrahlungen am LinAc, bzw. am HIT durchgeführt.
Aufgrund der horizontalen Strahlführung am HIT mussten die Behälter mit den Zellen aufrecht gestellt werden. Je nach applizierter Dosis und Feldgröße dauerte eine Bestrahlung bis
zu 15 min; um zu verhindern, dass die Zellen austrockneten wurden die Behälter vor der Bestrahlung mit vorgewärmtem Medium (inklusive 10% FCS und 1x Penicillin/Streptomycin)
aufgefüllt. Nach der Bestrahlung wurde das überschüssige Medium wieder entfernt. Zellen
auf OT wurden dazu in den ersten Steckplatz steriler 5-Objektträger-Boxen gestellt. Die Zellseite zeigte in Richtung der unbesetzten Steckplätze und in Richtung der Strahlenquelle. Die
Dicke des Range shifters wurde so angepasst, dass sich mit dem zusätzlich durchstrahlten
Medium wieder eine wasseräquivalente Durchstrahlungstiefe von 30 mm vor der Isoebene
ergab, die mit der Zellebene zur Deckung gebracht wurde.
Am LinAc konnten die Zellen im Liegen bestrahlt werden, so dass es nicht erforderlich war
die Behälter mit Medium aufzufüllen. Nach der Bestrahlung wurde analog zum Vorgehen
am HIT dennoch das Medium ausgetauscht, um Sekundärschäden der Zellen durch Aktivierung des Mediums zu vermeiden. Mit Hilfe einer durchflusszytometrischen γH2AX-Messung
(DSB-Marker) konnte gezeigt werden, dass die gegenüber der HIT-Bestrahlung unterschiedliche Anordnung im Rahmen der Messgenauigkeit keinen Einfluss auf das Messergebnis hatte
(siehe Abb. 2.3).
2.3.1. Dosimetrie
Alle im Rahmen der Experimente angegebenen Strahlendosen sind in Gy angegeben und
beziehen sich auf die Energiemenge, die in 1 kg reinem Wasser absorbiert wird (wasseräquivalente Dosis).
45
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
0
ZH
2A
XZ
Fl uo re sz en zZ(
Ro hw er te )
4Z000
3Z000
2Z000
1Z000
stehend
liegend
G1 S G2 MalleZellen
Abbildung 2.3. | Einfluss der Bestrahlungsanordnung. Vergleich desγH2AX-Signals in U87 Zellen
2 h nach Bestrahlung mit 1 Gy Photonen am LinAc in „liegender“ (gemäß Abb. 2.2a) oder „stehender“
(gemäß Abb. 2.2b) Anordnung (FACS-Messung). Die Diagramme zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen aus 3 Replikaten. Die Versuchsanordnung hatte keinen Einfluss auf das Messergebnis.
Am Gammatron wurde die applizierte Dosis durch die Expositionsdauer festgelegt. Die monatlich gültige Energiedosisleistung (Gy·min–1) lag für eine gegebene Expositionsgeometrie und verschiedene Abstände von der Quelle tabelliert vor. Sie wurde experimentell bestimmt und hängt nach Gleichung (2.2) linear mit der Aktivität der Quelle zusammen. Aus der bekannten Zerfallsrate der Quelle konnte ihre Aktivität gemäß Gleichung (2.1) bestimmt werden, so dass sich die Energiedosisleistung vorausberechnen
ließ.
A(t) = A0 · e−λ t A(t) Aktivität zum Zeitpunkt t
A0 Anfangsaktivität
λ Zerfallskonstante
(2.1)
Ḋ = Γ · A
r2 Ḋ Energiedosisleistung
Γ Dosisleistungskonstante
A Aktivität
r Abstand vom punktförmigen Strahler
(2.2)
Am LinAc wurde die applizierte Dosis mit Hilfe einer Messsonde kalibriert, die auf dem
Prinzip der Ionisationskammer beruhte. Die Sonde wurde dazu zwischen die Behälter
mit den zu bestrahlenden Zellen gelegt. Zur Kontrolle wurde die Dosis, die tatsächlich
unmittelbar an der Zellebene ankam, mit Hilfe von Thermolumineszenz-Chips [177]
überprüft. Dazu wurden 5 T25-Flaschen oder 5 T75-Flaschen mit je einem Chip unter den selben Versuchsbedingungen bestrahlt, die auch bei den Zellbestrahlungen
herrschten (inklusive der entsprechenden Menge Medium in den Flaschen). Die Chips
waren bei 1 Gy mit 1% Genauigkeit am Gammatron kalibriert worden. Ihre Auswertung ergab für eine Solldosis von 1 Gy am LinAc die Messwerte 1,00±0,01 Gy für die
T25-Flaschen und 0,99±0,01 Gy für die T75-Flaschen.
Am HIT wurde zur gleichmäßigen Dosisapplikation die zu bestrahlende Fläche in der Isoebene (wo sich die Zellen befanden) in ein Raster eingeteilt. Jeder Rasterpunkt wurde
in mehreren Durchgängen mit dem Ionenstrahl abgescannt, wobei unterschiedliche nominelle Ionenenergien eingesetzt wurden. In der Summe ergab sich daraus ein 8 mm
46
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
breiter spread-out Bragg-Peak, dessen Zentrum in der Isoebene und eine nahezu homogene Fluenz durch die gesamte bestrahlte Fläche. Die entsprechend komplexen Strahlpläne für diverse Dosen lagen bereits für die verwendeten Versuchsanordnungen vor.
Am SNAKE war bei der verwendeten Versuchsanordnung keine genaue Dosimetrie möglich. Die Zellebene lag im Bragg-Peak der monoenergetischen Ionen; deren Energie
betrug jedoch nur 2,92 MeV·u–1, so dass bereits dünne Flüssigkeitsfilme über den Zellen zu einer Verschiebung des Bragg-Peaks, bis zur vollständigen Abschirmung von den
Ionen führen konnte. Bei der Bestrahlung musste daher anhängendes Medium durch
Aufsetzen der DG-Kante auf Saugpapier minimiert werden, ohne die Zellen austrocknen zu lassen. Für die Bestrahlung wurde ebenfalls ein Rasterscan-Verfahren benutzt,
allerdings in kleinerem Maßstab: die Bestrahlungsfläche betrug insgesamt 2x7 mm.
2.4. Proteinanalyse
2.4.1. Geräte
Gerät Bezeichnung Hersteller
Elektrophoresekammer Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad
XCell SureLock Mini Cell Invitrogen
Filmentwicklungsmaschine CURIX 60 Agfa HealthCare
Netzgerät (Elektrophorese/Blotter) EPS 301 Amersham Pharmacia
Rotationsmixer Reax 2 Heidolph
Röntgenfilmkassette für 18x24 cm Filme Dr. Goos-Suprema
Scanner Scanjet 5470c Hewlett-Packard
Semi-Dry-Blotter Trans-Blot SD Bio-Rad
Thermomixer für 1,5 – 2,0 mL
Röhrchen
Thermomixer compact Eppendorf
UV/Vis Spectrophotometer Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech
2.4.2. Materialien
Bezeichnung Bezugsquelle Art.-Nr.
Antikörperset „Double Strand Breaks Repair“ Cell Signaling Technology 9653S
Antikörperset „Autophagy“ Cell Signaling Technology 4445S
Antikörperset „Cell Cycle Regulation II“ Cell Signaling Technology 9870S
Blot-Membran aus Nitrocellulose, 0,45µm
Porengröße (Amersham Hybond-ECL)
GE Healthcare RPN 303 D
Blot-Membran aus PVDF, 0,45µm Porengröße
(Immobilon-P)
Millipore IPV H00 010
Blotpapier, extra dick Bio-Rad 1 703 965
Chemilumineszenz-Substrat (LumiGLO) Cell Signaling Technology 7003S
47
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Bezeichnung Bezugsquelle Art.-Nr.
Einwegküvetten aus Polystyrol, 10 mm optische
Pfadlänge
BRAND 759 015
Entwicklerlösung für Röntgenfilme Agfa HealthCare G153
Fixierlösung für Röntgenfilme Agfa HealthCare G354
Faltenfilter aus Cellulose, 65 g/m2 neoLab Migge 11 417
HRP-gekoppelter Sekundärantikörper, Esel-AntiKaninchen IgG (H+L)
Cell Signaling Technology 7074S
NuPAGE Antioxidans Invitrogen NP0005
NuPAGE Transferpuffer Invitrogen NP0006
NuPAGE Tris-Acetat SDS Laufpuffer Invitrogen LA0041
Röntgenfilme, 18x24 cm (Amersham Hyperfilm
ECL)
GE Healthcare 28 906 837
Polyacrylamidgele 4 – 20%, Tris-Glycin
(Pierce Precise, 15 Taschen)
Thermo Scientific 25 274
Polyacrylamidgele 12%, Tris-Glycin (MiniPROTEAN TGX, 10 Taschen)
Bio-Rad 456-1043S
Polyacrylamidgele 3 – 8%, Tris-Acetat
(NuPAGE Novex, 15 Taschen)
Invitrogen EA 03 755 BOX
Protease Inhibitor Tabletten (cOmplete, Mini) Roche Applied Sciences 04 693 124 001
Proteintest nach Bradford Bio-Rad 500-0006
Proteinextraktions-Kit (Qproteome Mammalian
Protein Prep Kit)
Qiagen 37 901
Proteinleiter zur Markierung des Molekulargewichts (Pierce PageRuler Plus Prestained)
Thermo Scientific 26 619
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma-Aldrich P 5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma-Aldrich P 0044
pRAD52-AK: Anti-RAD52 (Phospho-Tyr104),
polyklonal (Kaninchen)
Assay Biotechnology A1119
2.4.3. Lösungen
Lösung Herstellung
AK-Puffer WB 50 mg·mL–1 BSA, 0,1% Tween-20 in 1x TBS. Tween-20 zum Schluss
unter Rühren zugegeben (schäumt stark).
Blockpuffer 50 mg·mL–1 Magermilchpulver, 0,1% Tween 20 in 1x TBS. Tween
20 zum Schluss unter Rühren zugegeben (schäumt stark).
Ladepuffer (3x) 187,5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 60 mg·mL–1 SDS, 30% Glycerin,
0,3 mg·mL–1 Bromphenolblau, 15% β-Mercaptoethanol. Aliquots
ohne β-Mercaptoethanol bei –20°C lagern, β-Mercaptoethanol direkt vor Verwendung ergänzen.
Laemmli Stammlösung (10x) 0,25 M Tris, 1,92 M Glycin, Lagerung bei 4°C.
Laemmli Laufpuffer (pH 8,3) 10% Laemmli Stammlösung, 1 g·L–1 SDS.
48
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Lösung Herstellung
Laemmli Transferpuffer (pH 8,5) 10% Laemmli Stammlösung, 20% Methanol.
Lysepuffer Grundlage: Qproteome Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen). Folgende Verdünnungen in Mammalian Cell Lysis Buffer:
1:100 Protease Inhibitoren aus dem Kit, 1 U·mL–1 Benzonase Nuklease aus dem Kit, 1:100 Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 (Sigma-Aldrich), 1:100 Phosphatase Inhibitor Cocktail 3
(Sigma-Aldrich), 1 cOmplete, Mini Protease Inhibitor Tablette
(Roche Applied Sciences) pro 10 mL Lysepuffer (Stammlösung
zur Herstellung abweichender Mengen: 1 Tablette in 10 mL
Mammalian Cell Lysis Buffer).
Ponceau S Färbelösung 1 g·L–1 Ponceau S, 5% Essigsäure.
10x TBS 200 mM Tris, 1.37 M NaCl, pH mit HCl auf 7,6 einstellen.
TBS-T Waschpuffer 0,1% Tween-20 in 1x TBS.
2.4.4. Proteinaufreinigung
Für Proteinanalysen wurden U87 Zellen in T75-Flaschen zu definierten Zeitpunkten nach
Bestrahlung geerntet. Dazu wurde das Medium aus den Flaschen abgegossen und Reste wurden mit Hilfe einer Pasteurpipette und einer Absaugpumpe entfernt. Der Zellrasen wurde 2x
behutsam mit 5 mL PBS gewaschen und nach Absaugen der PBS-Reste mit 300µL Lysepuffer 10 min lang bei RT inkubiert. Von dem Lysepuffer wurden für jedes Experiment 1 – 2 mL
mehr hergestellt, als für die Zellernte erforderlich war, da er auch bei der Proteinbestimmung
nach Bradford benötigt wurde (siehe Abschnitt 2.4.5). Die Zellen lösten sich bei Kontakt mit
dem Lysepuffer sofort vom Flaschenboden und wurden, unterstützt durch den Einsatz von
Zellschabern, in einer Ecke der Flasche gesammelt. Nach der Inkubationszeit wurden die Lysate in 2 mL Röhrchen überführt, kurz gevortext und dann 10 min bei 4°C und ∼14 000x g
(12 000 U·min–1) zentrifugiert, um Zelltrümmer und DNA zu sedimentieren. Die Proteinfraktion im Überstand wurde in frische 1,5 mL Röhrchen pipettiert und bei –20°C eingefroren.
2.4.5. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford
Proteinkonzentrationen wurden mit einem Proteintest bestimmt, der auf der kolorimetrischen Messung nach Bradford [178] beruht (Bio-Rad). Das Färbereagenz wurde 1:5 mit
deionisiertem Wasser verdünnt und durch einen Faltenfilter aus Cellulose gegeben. Für die
Messung wurden Aliquots der zu bestimmenden Proben in der Regel 1:4 verdünnt, und es
wurden Konzentrationsstandards mit 0,0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 und 1,0 mg·mL–1 bovinem Serumalbumin (BSA) hergestellt. Die Standards enthielten außerdem den Lysepuffer,
der zur Proteinaufreinigung verwendet wurde (siehe Abschnitt 2.4.4) in derselben Verdünnung wie die Aliquots der Proben. Von den Proben und Standards wurden 20µL mit 1 mL
des verdünnten Farbstoffkonzentrats gemischt und in Einwegküvetten mit einer optischen
Pfadlänge von 10 mm überführt.
Nach 5 min Inkubation bei RT wurde die Extinktion bei 595 nm Wellenlänge gemessen,
wobei die Standardlösung ohne BSA zur Nullpunktkorrektur genutzt wurde. Aus den Extinktionswerten und bekannten Konzentrationen der Standards wurde mit Microsoft Excel
eine Eichgerade berechnet, mit der sich anschließend die Gesamtprotein-Konzentrationen
der Proben berechnen ließen. Zur Gewährleistung zuverlässiger Ergebnisse wurde darauf
49
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
geachtet, dass das Bestimmtheitsmaß der Eichgeraden mindestens 0,98 betrug und alle Bestimmungen innerhalb des Messbereichs der Eichgeraden lagen. War das nicht der Fall, so
wurde die Bestimmung wiederholt, ggf. mit geänderter Probenverdünnung.
Die bestimmten Gesamtprotein-Konzentrationen dienten als Ausgangspunkt für den Einsatz gleich großer Proteinmengen in nachfolgenden Western Blot Analysen (5µg). Die entsprechenden Volumina wurden ggf. leicht korrigiert, indem zunächst β-Actin als interne Kontrolle mit der Western Blot Methode nachgewiesen wurde. Die entwickelten Filme wurden
eingescannt und mit Hilfe der Bildanalysesoftware ImageJ ausgewertet. Dazu wurden die
Aufnahmen invertiert, so dass die β-Actin-Banden hell erschienen. Der mittlere Hintergrund
des Films wurde in einem Bereich ohne Banden gemessen und im gesamten Bild korrigiert.
Anschließend wurde die Gesamtintensität jeder Bande gemessen und mit der ersten Bande
ins Verhältnis gesetzt, bei der es sich immer um eine unbestrahlte Kontrolle handelte. Die so
erhaltenen Faktoren wurden mit dem eingesetzten Probenvolumen multipliziert, wodurch
sich die korrigierten Werte ergaben. Zur Absicherung wurde die β-Actin-Bestimmung mit
den korrigierten Werten wiederholt.
2.4.6. SDS-PAGE
Proteinextrakte wurden zur Vorbereitung von Western Blot Analysen mit Hilfe der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach ihrer Molekülmasse aufgetrennt. Dazu wurden standardmäßig vorgegossene Gele mit einem Acrylamid-Gradienten
von 4 – 20% (Pierce Precise, Thermo Scientific) und ein Puffersystem nach Laemmli [179]
verwendet. Für einige kleine Proteine (<60 kDa) kamen 12% Acrylamidgele (Mini-PROTEAN
TGX, Bio-Rad) zum Einsatz (gleiches Puffersystem), für besonders große Proteine wurden
3 – 8% Tris-Acetat-Gele (NuPAGE Novex, Invitrogen) mit zugehörigem Tris-Acetat-Puffer benutzt. Gemäß Abschnitt 2.4.5 wurden 5µg Gesamtprotein je Probe mit 5µL 3x Ladepuffer
inklusive β-Mercaptoethanol (siehe 2.4.3) versetzt, mit deionisiertem Wasser auf 15µL aufgefüllt und durch Auf- und Ab-Pipettieren gemischt. Zur Denaturierung der Proteine wurden
die Proben 5 min lang bei 95°C inkubiert, kurz abzentrifugiert und auf Eis abgekühlt.
Die Gele wurden in die Elektrophoresekammer eingespannt, der Laufpuffer wurde eingefüllt und die Geltaschen wurden mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle mit dem Puffer gespült,
um Gelrückstände und Luftblasen zu entfernen. Die Geltaschen wurden mit den Proben beladen. Zur Größenmarkierung wurden außerdem 5µL einer Proteinleiter aufgetragen. Alle
Western Blot Experimente zum direkten Vergleich von Photonen- und 12C-Ionen-Bestrahlung
wurden paarweise durchgeführt. Die Elektrophorese lief 1 h bei 90 V.
2.4.7. Western Blot
Nach der SDS-PAGE (siehe Abschnitt 2.4.6) wurde die Plastikeinfassung der Gele entfernt
und die Geltaschen wurden mit Hilfe einer Rasiermesserklinge abgetrennt. Eine Blot-Membran aus Nitrocellulose (Amersham Hybond-ECL) wurde mit ein wenig Überstand auf die
Gelmaße zugeschnitten. Gele, Membranen und extra dickes Blotpapier wurden 15 min in
Laemmli Transferpuffer äquilibriert. Anschließend wurde die Blot-Anordnung (Semi-dryVerfahren) gemäß Abbildung 2.4 aufgebaut, und eventuell eingeschlossene Luftblasen durch
Überrollen der oberen Lage Blotpapier mit einer serologischen Pipette herausgepresst. Der
Blot wurde 50 min bei 12 V (maximal 5,5 mA·cm–2) durchgeführt.
50
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Sicherheitsabdeckung
Kathodenplatte
Filterpapier (extra dick)
Acrylamidgel
Blot-Membran
Filterpapier (extra dick)
Grundeinheit mit Anode
Abbildung 2.4. | Blot-Anordnung. Aufbau für das Semi-dry-Verfahren. Quelle: Bio-Rad (modifiziert).
Für einige große Proteine wurden abweichend PVDF-Membranen (Immobilon-P, Millipore)
und ein Wet-blot-Verfahren benutzt. Die PVDF-Membranen wurden zur Aktivierung 30 s lang
in Methanol, 2 min in deionisiertem Wasser und 5 min in Transferpuffer inkubiert. Der WetBlot erfolgte in einer XCell SureLock Elektrophoresekammer mit Blot-Modul (Invitrogen)
nach Herstellerangaben 2 h bei 150 V (Tris-Acetat-Gele und -Puffersystem).
Nach dem Blot wurden die Membranen 5 min bei leichter Bewegung auf einem Taumler
mit 1x TBS gewaschen. Zur Kontrolle des Proteinübertrags wurden die Membranen kurz mit
25 mL Ponceau S Färbelösung inkubiert und anschließend mit deionisiertem Wasser entfärbt.
Nach vollständiger Entfärbung wurden die Membranen 1 h lang mit 25 mL Blockpuffer unter
langsamer Bewegung auf einem Taumler bei RT inkubiert, um unspezifische AntikörperBindungsstellen abzusättigen. Dieser Schritt entfiel beim Einsatz von PVDF-Membranen. Es
folgten 3x 5 min Waschschritte mit TBS-T, während denen AK-Lösung vorbereitet wurde.
Primärantikörper (1°AK) wurden in der Regel 1:1000 in AK-Puffer WB verdünnt. Abweichend davon wurde der β-Actin-Antikörper 1:2000 und der pRAD52-AK 1:500 eingesetzt.
Bei allen Antikörpern handelte es sich um Immunglobuline der Kategorie G (IgG) aus Kaninchen, mit Ausnahme des Cyclin A2 Antikörpers aus dem Set „Cell Cycle Regulation II“,
der aus der Maus stammte. Die Membranen wurden auf eine Kunststofffolie gelegt und in
ein 15 mL Falcon Röhrchen mit 5 mL 1°AK-Lösung eingeführt. Die Röhrchen wurden waagerecht auf einem Rotationsmixer mit entsprechender Haltevorrichtung befestigt ÜN bei 4°C
rotiert. Anschließend wurden die Membranen 3x 5 min mit 15 mL TBS-T gewaschen und
mit 5 mL HRP-gekoppelten Sekundärantikörper (2°AK) inkubiert (Ziege-Anti-Kaninchen IgG,
bzw. Pferd-Anti-Maus IgG, 1:2000 in AK-Puffer WB). Die Inkubation erfolgte 2 h wie zuvor
in Röhrchen auf einem Rotationsmixer.
Die Membranen wurden erneut 3x 5 min mit TBS-T gewaschen und dann 1 min mit 10 mL
Chemilumineszenz-Substrat (LumiGLO) pro Membran inkubiert. Danach wurden die Membranen luftblasenfrei in eine Klarsichthülle gelegt und mit Klebeband auf der Innenseite einer
Filmkassette fixiert. In einer Dunkelkammer wurden Röntgenfilme in die Kassette eingelegt
und belichtet. Die Belichtungszeit wurde für jedes zu detektierende Protein optimiert und
51
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
reichte von wenigen Sekunden bis hin zu 25 min. Die Filme wurden maschinell entwickelt,
fixiert, gewaschen und getrocknet. Zur Dokumentation wurden die Filme eingescannt.
2.5. Immunfluoreszenz-Färbungen für Mikroskopie und FACS
2.5.1. Geräte
Gerät Bezeichnung Hersteller
Durchflusszytometer FACSCalibur, Software: Multiset BD
Durchflusszytometer LSR II, Software: FACSDiva BD
Färbekästen* Rotilbo-Färbekästen Carl Roth
Fluoreszenzmikroskop Eclipse E600, Filter: DAPI/FITC/G-2A Nikon
Mikroskopkamera ColorView III, Software: cellF Olympus
HCS Mikroskop Axioplan 2 (Zeiss), Software: Metafer, inkl. MetaCyte MetaSystems
Wärmeschrank Heraeus UT6120 Thermo Scientific
*Einsätze für 24x24 mm Deckgläser, Spezialanfertigung, DKFZ Mechanikwerkstatt.
2.5.2. Materialien
Bezeichnung Bezugsquelle Art.-Nr.
Anti-Kaninchen 2°AK (AF594): Ziege-AntiKaninchen IgG (H+L), Alexa Fluor 594
konjugiert
Invitrogen A-11012
Anti-Maus 2°AK (AF488): Ziege-Anti-Maus IgG
(H+L), highly cross-absorbed, Alexa Fluor 488
konjugiert
Invitrogen A-11029
Anti-Maus 2°AK (AF647): F(ab')2-Fragmente
Ziege-Anti-Maus IgG (H+L), Alexa Fluor 647
konjugiert
Invitrogen A-21237
Casp3*-AK: Aktivierte Caspase-3 Antikörper,
Klon C92-605 (Kaninchen), Alexa Fluor 647
konjugiert
BD Pharmingen 560 626
Diagnostica-Objektträger, 3 Pipettierfelder
(∅14 mm)
neoLab Migge 45 179 065
Eindeckmedium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Eindeckmedium Immu-Mount Thermo Scientific Shandon 99-904-02
γH2AX-AK: Phosphohiston-H2AX (Ser139)
Antikörper, Klon 2F3 (Maus), Alexa Fluor 488
konjugiert
BioLegend 613 406
Glucose-Oxidase, lyophilisiert, ∼200 U·mg–1 Sigma-Aldrich 49 108
Katalase, ≥0,5·106 U·mg–1 Sigma-Aldrich 02 071
MG132, 10 mM in DMSO Merck 474 790
52
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Bezeichnung Bezugsquelle Art.-Nr.
pBRCA1-AK: Phospho-BRCA1 (Ser1524)
Antikörper, polyklonal (Kaninchen)
Cell Signaling Technology 9009S
pH3-AK: Phosphohiston-H3 (Ser10) Antikörper,
Klon D2C8 (Kaninchen), Alexa Fluor 555
konjugiert
Cell Signaling Technology 3475S
RNase A, lyophilisiert, 70 U·mg–1 Sigma-Aldrich R-5503
Röhrchen mit Zellsieb für die Durchflusszytometrie
BD Falcon 352 235
SuperKillerTRAIL Enzo Life Science ALX-201-115
2.5.3. Lösungen
Lösung Herstellung
AK-Puffer IF 30 mg·mL–1 BSA in PBS.
DAPI-Färbelösung F 1µg ·ml–1 DAPI in PBS.
DAPI-Färbelösung M 1µg ·ml–1 DAPI.
Fixierlösung F 45 mg·mL–1 PFA in PBS. Herstellung und Verwendung unter dem Abzug (giftige Stäube/Dämpfe). PFA unter langsamem Rühren bei 85°C in
PBS lösen (Becherglas mit Alufolie isolieren). Auf RT abkühlen lassen,
Endvolumen mit PBS einstellen und Lösung durch einen Cellulosefilter
geben.
Fixierlösung M 30 mg·mL–1 PFA, 20 mg·mL–1 Saccharose in PBS. Herstellung und Verwendung unter dem Abzug (giftige Stäube/Dämpfe). PFA und Saccharose unter langsamem Rühren bei 85°C in PBS lösen (Becherglas mit
Alufolie isolieren). Auf RT abkühlen lassen, Endvolumen mit PBS einstellen und Lösung durch einen Cellulosefilter geben.
MEA Eindeckmedium 100 mM β-Mercaptoethanolamin (MEA) in PBS, pH 7,4
Permeabilisierungspuffer 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccharose, 0,5%
Triton-X 100 pH 7,4 (ggf. einstellen mit HCl/NaOH).
PI-Färbelösung 5µg ·ml–1 PI in PBS.
RNase-Lösung 200µg ·ml–1 RNase A in Waschpuffer F
Switching Buffer 100mg·mL–1 D-Glucose, 50 mM MEA, ∼650 U·mL–1 Katalase,
∼100 U·mL–1 Glucose-Oxidase, alles gelöst in PBS (pH 7,4), in
der angegebenen Reihenfolge (Enzyme frisch vor Benutzung zugeben,
oder fertigen Switching Buffer aliquotieren und bei –20°C lagern).
SB– 10% Switching Buffer in 50 mM MEA/PBS (pH 7,4).
Waschpuffer F 5 g·L–1 BSA in PBS.
Waschpuffer M 0,1% Tween 20 in PBS.
2.5.4. Mikroskopie
Diagnostica-OT mit Zellen wurden zum gewünschten Zeitpunkt nach Bestrahlung in Glasküvetten mit Fixierlösung M 5 min bei RT inkubiert und dann in frische Küvetten mit 4°C
kaltem Permeabilisierungspuffer überführt. Alle nachfolgenden Schritte in Küvetten wurden
bei langsamer Bewegung auf einem Taumler durchgeführt. Die Proben wurden 15 min mit
53
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Permeabilisierungspuffer inkubiert und anschließend 4x 4 min mit Waschpuffer M gewaschen. Der γH2AX-Antikörper wurde 1:500 in AK-Puffer IF verdünnt (100 µL/Probe). Die
OT wurden aus der Waschlösung entnommen und die hydrophobe Beschichtung der OT wurde mit Saugpapier trocken gewischt, ohne die Benetzung der Pipettierfelder zu gefährden.
Auf 2 Feldern wurden 50µL AK-Lösung aufgetragen; auf das dritte Feld kam reiner AK-Puffer
IF (Leerkontrolle). Ab diesem Schritt wurden die Proben stets im Dunkeln gehalten. Zur Gewährleistung der vollständigen und gleichmäßigen Benetzung der Felder, wurden Deckgläser
auf die OT aufgelegt. Die Präparate wurden in einer feuchten Kammer ÜN bei 4°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Deckgläser entfernt und die Waschschritte wiederholt. Die
OT wurden analog zur Vorgehensweise beim 1°AK mit 2°AK inkubiert, wobei dieser 1:1000
verdünnt wurde und die Inkubation 1 h bei 37°C durchgeführt wurde. Die 4 Waschschritte wurden abermals wiederholt und um einen weiteren 4 min Waschschritt mit deionisiertem Wasser ergänzt. Anschließend wurden die OT 15 s lang in ein 50 mL Röhrchen DAPIFärbelösung M getaucht, um die Zellkerne zu färben. Überschüssige Lösung wurde durch
kurzes Eintauchen in ein Becherglas mit deionisiertem Wasser entfernt. Restliche Flüssigkeit
wurde mit Saugpapier abgenommen, ohne die Pipettierfelder zu berühren. Mit einem Glasstab wurde ein linsengroßer Tropfen Fluoromount-G wurde auf jedes Feld aufgetragen und
die OT wurden unter Vermeidung von Luftblasen mit 24x50 mm Deckgläsern bedeckt. Die
Präparate wurden ÜN bei RT in Pappmappen getrocknet und dann bei 4°C gelagert.
Mit Hilfe einer High content screening (HCS) Mikroskopie-Plattform der Firma MetaSystems wurden je Präparat mindestens 400 – 500 Zellen aufgenommen und ausgewertet. Das
System bestand aus einem Axioplan 2 Mikroskop (Zeiss) mit motorisiertem Objekttisch, das
von der Software Metafer (Version 4), inklusive dem Analyse-Modul MetaCyte gesteuert wurde (siehe Abb. 2.5). Die Zellen wurden mit einer Mikroskopkamera (CV-M42146, JAI) über
ein Luftobjektiv mit 40-facher Vergrößerung und einer Numerischen Apertur (NA) von 0,75
detektiert. Das System ermöglichte die Bearbeitung von 8 Präparaten in einem Lauf, wobei
mehrere Parameter auf einmal gemessen werden konnten. In ersten Experimenten wurde
lediglich die γH2AX Focianzahl pro Zellkern erhoben; später wurde außerdem die Fluoreszenzintensität im gesamten Zellkern, innerhalb der Foci und ohne Berücksichtigung der Foci
(pan-nukleär) gemessen, sowie die Fläche der Foci und des Zellkerns.
Abbildung 2.5. | HCS Mikroskop (MetaSystems). Das verwendete System bestand aus einem Fluoreszenzmikroskop mit 40x Luftobjektiv, einer Kamera und motorisiertem Objekttisch für bis zu 8 Präparate. Die Aufnahmen erfolgten computergesteuert mit der Software Metafer mit MetaCyte Modul.
54
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
2.5.5. Durchflusszytometrie
Für durchflusszytometrische Untersuchungen dienten 1 – 2·106 Zellen in T25 Flaschen als
Ausgangsmaterial. Für jede Probe wurden 2 mL Fixierlösung F hergestellt (plus ∼10% Überschuss), von denen 1 mL in 15 mL Röhrchen vorgelegt wurde. PBS und Trypsin-EDTA-Lösung
wurden im Wasserbad auf 37°C vorgewärmt und bei –20°C gelagertes 70% Ethanol (zur Permeabilisierung) wurde auf Eis gestellt. Mit 3 min Vorlauf vor dem gewünschten Zeitpunkt
zur Fixierung der Zellen wurde das Medium aus den Flaschen abgegossen, Reste wurden mit
einer Absaugpumpe und einer Pasteurpipette abgesaugt und der Zellrasen wurde mit 1 mL
PBS gewaschen. Das PBS wurde abgesaugt und durch 1 mL Trypsin-EDTA-Lösung ersetzt.
Nach ca. 30 s Inkubation bei RT wurden noch nicht vollständig abgelöste Zellen abgeklopft
und durch Überspülen des Bodens mit 1 mL Fixierlösung F gesammelt. Die Suspension wurde
durch Auf- und Ab-Pipettieren gemischt, in die vorbereiteten Röhrchen gegeben und durch
leichtes Schütteln mit der Vorlage gemischt.
Hierdurch ergab sich analog zum Mikroskopieprotokoll eine Endkonzentration der Fixierlösung von 3% PFA. Die Proben wurden 10 min bei RT inkubiert und dann bei 7°C und
200x g 5 min lang zentrifugiert. Alle nachfolgenden Zentrifugationsschritte wurden unter
den gleichen Bedingungen durchgeführt. Der Überstand wurde abgegossen und die pelletierten Zellen wurden in 3 mL eiskaltes 70% Ethanol resuspendiert. Die Proben wurden auf
Eis gesammelt und bei 4°C gelagert.
Die Proben wurden zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen wurden in 3 mL
Waschpuffer F resuspendiert. Auf diese Weise wurden 3 Waschschritte durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen in 100µL 1:20 verdünntem γH2AX-AK in AK-Puffer IF resuspendiert, 1 h lang bei RT inkubiert und gelegentlichem aufgeschüttelt. Ab diesem Schritt
wurden die Proben stets in Dunkeln gehalten. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen abermals pelletiert und nach Abnehmen des Überstands mit einer Kolbenhubpipette in
250µL PBS resuspendiert.
Die Suspensionen wurden durch das Zellsieb im Deckel spezieller Röhrchen für die Durchflusszytometrie (BD Falcon) pipettiert, auf Eis gestellt und kurz vor der Messung noch einmal
aufgeschüttelt. Zur Messung wurde für erste Versuche das Durchflusszytometer FACSCalibur
(BD) benutzt; später machte die Erweiterung der Färbung den Einsatz des Modells LSR II
(BD) erforderlich (siehe Methodenentwicklung).
2.6. Datenerhebung und statistische Auswertung
Alle Hauptversuche wurden mindestens ein- bis zweimal wiederholt, mit Ausnahme der sehr
aufwändigen Untersuchungen mit superauflösender Mikroskopie. Für die Durchflusszytometrie (FACS) und High content screening (HCS) Mikroskopie wurden bei jedem Experiment
3 separate Proben (Replikate) zu jedem Datenpunkt gemessen (3-fach Bestimmung). FACSMessungen umfassten mindestens 1 – 2·104 Ereignisse innerhalb des Gates Zellen (siehe Abschnitt 3.1.5) und für die HCS Mikroskopie wurden von jeder Probe mindestens 500 Zellen
aufgenommen (Ausschuss nach Qualitätskontrolle typischerweise <10%).
In beiden Fällen wurden aus den Messwerten zu jeder erhobenen Messgröße der Median bestimmt. Soweit nicht anders angegeben, zeigen die Diagramme im Ergebnisteil die
arithmetischen Mittelwerte dieser Mediane aus allen zusammengehörenden Replikaten und
55
Kapitel 2: Materialien und Standardmethoden
Wiederholungen eines Experiments. Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts an. Auffällige Unterschiede zwischen den so erhaltenen Datenpunkten wurden mit
Hilfe von einseitigen t-Tests auf Signifikanz geprüft. Dazu wurden zunächst durch F-Tests
geprüft, ob sich die Varianz der Datenpunkte unterschied. War dies der Fall, so wurde ein heteroskedatischer Test (Welch-Test) durchgeführt, ansonsten ein homoskedatischer. Getestet
wurde die Nullhypothese (kein Unterschied zwischen beiden Messreihen) zum Signifikanzniveau von 0,05. An einigen Stellen wurde in den Diagrammen auf hochsignifikante oder
nicht signifikante Unterschiede hingewiesen.
56
3 METHODENENTWICKLUNG
In diesem Abschnitt wird erläutert, wie und warum die angewandten Methoden modifiziert
und weiterentwickelt wurden, um zu den Protokollen zu gelangen, mit denen die Hauptversuche im Ergebnisteil dieser Arbeit durchgeführt wurden. Die erforderlichen Materialien und
Lösungen sind in den entsprechenden Tabellen in Kapitel 2 zu finden.
3.1. Durchflusszytometrie
DSB-Induktion, γH2AX-Expression, der Zellzyklus und die Einleitung von Apoptose sind eng
ineinandergreifende Prozesse. Betrachtet man sie getrennt voneinander, so ergibt sich nur
ein unvollständiges Bild. Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Erhebung multivariater
Daten mit einem hohen Durchsatz, und eignet sich deshalb in besonderer Weise für die Untersuchung komplexer Zusammenhänge. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung einer durchflusszytometrischen Methode zur gleichzeitigen Messung von γH2AX,
dem Zellzyklus und der Apoptose. Insbesondere sollte untersucht werden, ob U87 Zellen als
Modell für Glioblastomzellen in verschiedenen Zellzyklusphasen unterschiedlich sensitiv auf
ionisierende Strahlung reagieren, und ob sich dabei Unterschiede zwischen der Bestrahlung
mit Photonen und 12C-Ionen zeigen.
Auf die Synchronisierung der Zellen zur Untersuchung einer bestimmten Zellzyklusphase
wurde explizit verzichtet, da dies einen erheblichen Eingriff in das eng verflochtene Regulationsnetzwerk der genannten Prozesse bedingt, und die zu messenden Parameter potenziell
stark beeinflusst. Im Übrigen bot sich mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Möglichkeit zur
getrennten Betrachtung aller Zellzyklusphasen, auch ohne Synchronisierung. Zur Umsetzung
der geforderten Methode wurde das in Abschnitt 2.5.5 beschriebene Ausgangsprotokoll zur
alleinigen γH2AX-Messung systematisch erweitert. Im Folgenden werden die maßgeblichen
Schritte dazu aufgezeigt und anhand von Ergebnissen aus Vorversuchen erläutert. Das endgültige Protokoll findet sich schließlich in Abschnitt 3.1.4.
3.1.1. Berücksichtigung von Zellzyklus und Apoptose
Aufgrund des unterschiedlichen DNA-Gehalts lassen sich die Zellzyklusphasen G1, S und
G2/M anhand der Intensität eines fluoreszenten DNA-Farbstoffs voneinander unterscheiden.
Außerdem können apoptotische Zellen detektiert werden, die nach Fragmentierung der DNA
kleinere Signalintensitäten aufweisen als G1-Zellen; sie bilden eine eigene Verteilung, die vor
dem G1-Peak liegt und daher als subG1-Peak bezeichnet wird [180].
Um die zellzyklusspezifische γH2AX-Messung zu realisieren, wurde zunächst versucht,
nach der Immunfärbung die DNA mit Propidiumiodid (PI) zu markieren. Die klassischen Protokolle für eine derartige Färbung sehen meist eine alkoholische Fixierung vor, die jedoch bei
Immunfärbungen eher unüblich ist. Deshalb wurden verschiedene Fixierungsarten getestet
und mit der PFA-Fixierung verglichen, darunter die Fixierung mit 70% Ethanol (vorgekühlt
57
Kapitel 3: Methodenentwicklung
auf –20°C), ≥ 30 min auf Eis und mit 2% Essigsäure in PBS (angegeben sind die Endkonzentrationen nach Zugabe der Zellsuspension). Hierzu wurden U87 oder MRC-5 Zellen am
Gammatron mit Photonen bestrahlt, nach 30 min mit Trypsin-EDTA-Lösung geerntet und in
mehrere Röhrchen verteilt, und unterschiedlich fixiert. Da hierzu mehr Zellen erforderlich
waren als üblich, wurden statt T25-Flaschen T75-Flaschen benutzt.
Vor der Antikörper-Inkubation wurde ein einstündiger Verdau mit 1 mL RNase-Lösung
(200µg ·ml–1 RNase A in Waschpuffer F) bei 37°C durchgeführt, um RNA abzubauen (PI
interkaliert doppelsträngige RNA-Abschnitte, deshalb verfälscht RNA die Messung des DNAGehalts). Bei grundsätzlich gleicher Vorgehensweise wie im Ausgangsprotokoll (siehe Abschnitt 2.5.5) ergab sich daraus die folgende Variante: Ernte der Zellen — Fixierung mit PFA,
Ethanol oder Essigsäure — Permeabilisierung mit 70% Ethanol (kein Extraschritt bei Ethanolfixierung) — 3 Waschschritte mit Waschpuffer F (5mg·mL–1 BSA in PBS) — RNase-Verdau
— Antikörper-Inkubation — Resuspendierung der Zellen in PI-Färbelösung (5µg ·ml–1 PI in
PBS) — Filtrieren (Zellsieb) und Messen der Zellen. Zur genaueren Begutachtung der Färbung wurden außerdem 20µL der Proben auf OT pipettiert, mit einem Deckglas bedeckt und
unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Die Art der Fixierung beeinflusste das Messergebnis erheblich: Ethanolfixierung und Essigsäurefixierung führten zu einer vergleichbar guten Trennung der Zellzyklusphasen, während
PFA-Fixierung breitere G1- und G2/M-Verteilungen verursachte und damit die zuverlässige
Bestimmung der S-Phase erschwerte (siehe Abb. 3.1). Beim γH2AX-Signal zeigte sich eine lineare Dosiskorrelation bei PFA- und Essigsäurefixierung mit guter Übereinstimmung der Absolutwerte; Ethanolfixierung verhinderte hingegen offenbar die Antikörperbindung, da hier
keine Veränderung der Signalintensität zu beobachten war (siehe Abb. 3.2). Die mikroskopische Betrachtung der Zellen bestätigte dies, jedoch lag das Signal nach Essigsäurefixierung
diffus im Zellkern verteilt vor, und nur bei PFA-Fixierung waren wie erwartet γH2AX Foci
erkennbar.
Für rein durchflusszytometrische Untersuchungen stellte sich somit die Essigsäurefixierung
als geeignete Wahl heraus, stand aber der Absicht im Wege die Proben mit nur einer Färbung
parallel mikroskopisch auszuwerten. Außerdem war es fraglich, ob diese Art der Fixierung
die Erweiterung der Färbung mit zusätzlichen Antikörpern zulassen würde. Aus diesen Gründen wurde nach alternativen DNA-Farbstoffen gesucht, die auch bei PFA-Fixierung eine gute
Trennung der Zellzyklusphasen erlauben. Mit Hinblick auf die Kombination mit der Mikroskopie wurde die Färbung mit 4',6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) getestet.
Bei gleichem Vorgehen wie für die PI-Färbung nach PFA-Fixierung, wurden die Zellen
dazu nach der Antikörper-Inkubation in DAPI-Färbelösung F (1µg ·ml–1 DAPI in PBS) resuspendiert. Der RNase-Verdau ist bei dieser Färbung nicht unbedingt erforderlich, weil DAPI
eine wesentlich höhere Spezifität für DNA aufweist, wurde jedoch trotzdem beibehalten. Die
Messung erfolgte mit dem Durchflusszytometer LSR II, da das FACSCalibur nicht über den
erforderlichen UV-Laser zur Anregung von DAPI verfügte. Darüber hinaus bot das LSR II die
notwendige Flexibilität für zusätzliche Erweiterungen der Färbung
Diese Variante wurde weiter verfolgt, denn sie erwies sich in zweierlei Hinsicht als besonders geeignet: Zum Ersten ermöglichte sie die beste Trennschärfe aller getesteten Alternativen zur Zellzyklusanalyse (siehe Abb. 3.1c). Zum Zweiten behinderte DAPI im Unterschied
zu PI nicht die Erweiterung der Färbung mit orange- und rot-fluoreszierenden Farbstoffen,
da das Emissionsspektrum im blauen Bereich liegt. Die Anregung mit einem separaten UV58
Kapitel 3: Methodenentwicklung
0
20
40
60
80
100
/
Gd es GM
ax im um s 3% PFA / PI
0 200 400 600 800 1K 0 200 400 600 800 1K
0
20
40
60
80
100
MRC-5GZellen
PIG(DNA-Gehalt)
/
Gd es GM
ax im um s 70% Ethanol / PI
PIG(DNA-Gehalt)
G1
S
G2/M
a 0
20
40
60
80
100
%
hd es hM ax im um s 3% PFA / PI
0 200 400 600 800 1K 0 200 400 600 800 1K
0
20
40
60
80
100
U87hZellen
PIh(DNA-Gehalt)
%
hd es hM ax im um s 2% Essigsäure / PI
PIh(DNA-Gehalt)
b 0 200 400 600 800 1K
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1K
0
20
40
60
80
100
U87iZellen
DAPI-Ai(DNA-Gehalt)
%
id es iM ax im um s %
id es iM ax im um s 3% PFA / DAPI 2% Essigsäure / PI
DAPI-Ai(DNA-Gehalt)
c Abbildung 3.1. | Einfluss des Fixiermittels auf die Zellzyklusmessung. (a) Die Fixierung mit 70%
Ethanol erlaubte im Vergleich zu 3% PFA eine schärfere Trennung der Zellzyklusphasen bei PI-Färbung
in MRC-5 Zellen. (b) PFA-Fixierung und PI-Färbung führte in U87 Zellen zu ähnlich schlechten Ergebnissen wie in MRC-5 Zellen, bei Essigsäurefixierung war die Trennschärfe vergleichbar gut wie bei
Ethanolfixierung. (c) DAPI-Färbung nach PFA-Fixierung bot eine noch bessere Trennschärfe.
59
Kapitel 3: Methodenentwicklung
MRC-5
0
100
200
300
400 DNAy(PI)
3H
yP FA
70
H
yE th an ol 30yminynachyBestrahlungymity2yGyyPhotonen
3HyPFA
70HyEthanol
42 6
Dosis(Gy)
10yµm
yH 2A
Xy Fl uo re sz en z yH2AX
a U87
100
150
200
250 DNAo5PI)
3H
oP FA
2H
oE ss ig sä ur e 50
30ominonachoBestrahlungomito2oGyoPhotonen
3HoPFA
2HEssigsäure
42 6
0
Dosis5Gy)
10oµm
oH 2A
Xo Fl uo re sz en z oH2AX
b Abbildung 3.2. | Einfluss des Fixiermittels auf das γH2AX-Signal. (a) Fixierung mit 3% PFA im Vergleich zu 70% Ethanol (MRC-5 Zellen) und (b) 3% PFA im Vergleich zu 2% Essigsäure (U87 Zellen).
Die Diagramme zeigen die Fluoreszenzintensität des γH2AX-Antikörpers 30 min nach Bestrahlung
mit verschiedenen Dosen Photonen. Die mikroskopischen Aufnahmen zeigen typische Ergebnisse der
DNA-Färbung mit Propidiumiodid (PI) und des γH2AX-Signal bei 2 Gy.
Laser vermied zusätzlich Signalüberlagerungen mit anderen Fluorophoren, weil die räumliche Trennung der optischen Pfade zu einer zeitlich leicht versetzten Messung der jeweils
angeregten Fluorophore führt.
3.1.2. Erweiterte Apoptose-Messung
Wie bereits in Abschnitt 3.1.1 geschildert, wurde DNA-Fragmentierung als Endpunkt für
die Apoptose herangezogen und anhand des subG1-Peaks im DAPI-Histogramm nachgewiesen. Neben der Apoptose können jedoch auch weitere Prozesse wie Nekrose oder andere
Arten des programmierten Zelltods zur Fragmentierung der DNA führen, die nicht mit der
Aktivierung von Caspasen einhergehen. Zur spezifischen Messung der Apoptose wurde die
Immunfärbung deshalb um einen Caspase-3-Marker erweitert. Der verwendete Alexa Fluor
647-gekoppelte Antikörper bindet ausschließlich an die aktive Form (Casp3*).
60
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Validierung der Apoptose-Messung
Um den Prozentsatz der Apoptose anhand des subG1-Peaks nicht zu überschätzen, ist es
wichtig, kleine Zelltrümmer und apoptotische Körperchen von der Analyse auszuschließen.
Dies kann durch einen Größenausschluss geschehen, doch wo die Grenze zu setzen ist zwischen Zelltrümmern und bereits geschrumpften, aber noch nicht komplett in apoptotische
Körperchen zerfallenen Zellen, lässt sich nicht ohne Weiteres festlegen. Es stellte sich auch
die Frage, wie gut sich mit dem verwendeten Casp3*-AK apoptotische von nicht apoptotischen Zellen unterscheiden ließen, und welches Bild sich durch den Vergleich mit der subG1Quantifizierung ergäbe.
Zur Klärung dieser Fragen wurde in U87 Zellen mit Hilfe von SuperKillerTRAIL und MG132
gezielt Apoptose ausgelöst. Die Zellen wurden in T75-Flaschen bei etwa 80% Konfluenz mit
5 ng·mL–1 SuperKillerTRAIL plus 2,5µM MG132 behandelt. Beide Substanzen wurden dem
regulärem Medium hinzugefügt. Unbehandelte Kontrollen wurden eingeschlossen. Die Zellen wurden 20 h lang im Brutschrank inkubiert und dann für die Durchflusszytometrie aufgearbeitet. Eine Kontrolle unter dem Phasenkontrast-Mikroskop zeigte, dass die behandelten
Zellen zu einem großen Teil kugelig aussahen, jedoch noch überwiegend am Flaschenboden
anhafteten. Daneben fanden sich viele Zellen mit unauffälliger Morphologie, so wie sie auch
die unbehandelten Zellen zeigten.
Um keine bereits vom Flaschenboden abgelösten Zellen zu verlieren, wurde das Medium
nicht sofort verworfen, sondern in 50 mL Röhrchen pipettiert und auf Eis gestellt. Die Zellen
in den Flaschen wurden routinemäßig abgelöst und ebenfalls in das Röhrchen gegeben, so
wie das PBS, das vor und nach dem Einsatz der Trypsin-EDTA-Lösung zum Spülen des Flaschenbodens verwendet wurde. Die Röhrchen wurden 10 min bei 200x g und 7°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellpellets wurden in 6 mL PBS resuspendiert.
Davon wurde je 1 mL in ein 15 mL Röhrchen überführt, um parallel zu der Immunfärbung
nach PFA-Fixierung als Referenzmethode eine Apoptosemessung anhand des subG1-Peaks
nach Nicoletti [180] durchzuführen:
Für die Nicoletti-Färbung wurden die Zellen nochmals zentrifugiert und nach Abgießen
des Überstands in Nicoletti-Färbelösung resuspendiert. Im Gegensatz zu der OriginalRezeptur wurde 1µg ·ml–1 DAPI an Stelle von 50µg ·ml–1 PI als DNA-Farbstoff verwendet (in 1 mg·mL–1 Natriumcitrat und 0,1% Triton-X 100). Die Nicoletti-Proben wurden
bis zur Fertigstellung der übrigen Proben bei 4°C aufbewahrt.
Für die Immunfärbung wurden die Proben wie zuvor mit PFA-Lösung fixiert, mit 70%
Ethanol permeabilisiert und nach 3 Waschschritten erfolgte ein RNase-Verdau, diesmal
mit 5 mL Volumen. Anschließend wurden die Proben in 5x 1 mL Portionen unterteilt,
so dass neben der Komplettfärbung DNA/γH2AX/Casp3* auch Einzelfärbungen und
Leerkontrollen realisiert werden konnten. Die Extraproben dienten der Kompensation eventueller Signalüberlagerungen der verschiedenen Fluorophore. Der Casp3*-AK
wurde wie der γH2AX-AK 1:20 in AK-Puffer (30 mg·mL–1 BSA in PBS) verdünnt (für die
Komplettfärbung in derselben Lösung). Die Antikörper-Inkubation und alle restlichen
Schritte erfolgten wie zuvor beschrieben.
Bei der Immunfärbung zeigten die behandelten Zellen ein deutlich erhöhtes Casp3*-Signal
gegenüber den Kontrollen, das bestätigte, dass der Antikörper funktionierte (siehe Abb. 3.3).
61
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Außerdem wiesen die behandelten Proben einen klar definierten subG1-Peak auf, der sich
leicht von Zelltrümmersignalen unterscheiden ließ: die Signale der Zelltrümmer waren kleiner und im Gegensatz zum subG1-Peak Casp3*-negativ (siehe Abb. 3.4).
Alexa647bAoRCasp3LGI
0
20
40
60
80
100
9
od es oM ax im um s 101 102 103 104 105
Casp3LGCasp3L
_ Kontrolle 0P69
SuperKillerTRAILoGoMG132 81P51
9oCasp3LGProbe
Abbildung 3.3. | Validierung des Casp3*-AK. Analyse von U87 Zellen 20 h nach Apoptoseinduktion
mit MG132 und SuperKillerTRAIL: Einteilung in Casp3*-positive und -negative Ereignisse.
Die Abtrennung der Trümmer sollte jedoch nicht auf Grundlage des DAPI-Histogramms
erfolgen, da die Einteilung bei kleinen Apoptoseraten weniger eindeutig ausfällt und das
DAPI-A-Signal gewissen Schwankungen unterworfen ist (DAPI bindet stöchiometrisch an
DNA, weshalb unterschiedliche Zellzahlen die Stärke des Signals beeinflussen, so dass die
auf DAPI basierenden Gates für jede Probe angepasst werden müssen).
Die meisten Trümmer ließen sich in der Auftragung des Vorwärtsstreulichts (FSC-A) gegen
das Seitwärtsstreulicht (SSC-A) abtrennen (siehe Abb. 3.4). Während das in Durchflussrichtung gestreute Vorwärtsstreulicht ein Maß für die Größe des registrierten Objekts darstellt,
hängt die seitliche Streuung von der Granularität des Objekts ab. Zelltrümmer sind nicht
nur kleiner als ganze Zellen, sie verursachen auch weniger Seitwärtsstreulicht, da beim Aufbrechen der Plasmamembran die Licht streuenden Bestandteile (hauptsächlich die Zellorganellen und andere membranumschlossene Kompartimente) voneinander getrennt werden.
Daher traten besonders kleine SSC-A-Signale erst ab einem unteren FSC-A-Wert auf, der die
Grenze zwischen intakten Zellen und Trümmern anzeigte.
Zur feineren Abtrennung weiterer Trümmersignale eignete sich die Auftragung DAPI-A
gegen DAPI-W. Der Parameter DAPI-W gibt an, wie lange ein Objekt während seines Durchgangs durch die Durchflusskammer ein messbares Signal im DAPI-Detektor erzeugt; diese
Dauer ist bei Zelltrümmern deutlich kleiner als bei ganzen Zellen und noch weitestgehend
erhaltenen subG1-Zellen (siehe „Abknicken“ der Signale links unten in Abb. 3.4). Außerdem
wurde die Auftragung DAPI-A gegen DAPI-W dazu benutzt zusammenhängende Zellen von
Einzelzellen zu unterscheiden; insbesondere erlaubte dies die Abgrenzung von G1-Dubletten
aufgrund ihres höheren DAPI-W-Signals im Vergleich zu Einzelzellen in der G2- oder M-Phase
(allein auf Grund des DAPI-A-Signals ist dies nicht möglich).
Die Messungen ergaben einen klar definierten subG1-Peak in den behandelten Proben, der
sich leicht von Zelltrümmersignalen unterscheiden ließ. Die Quantifizierung lieferte bei der
Immunfärbung ähnliche Werte wie bei der Referenzmethode nach Nicoletti, wobei sich der
subG1-Peak bei der Immunfärbung deutlicher von den Zellen ohne DNA-Fragmentierung
abhob (siehe Abb. 3.5). Weiter zeigte sich bei der Immunfärbung ein Anstieg des Casp3*62
Kapitel 3: Methodenentwicklung
DAPIcAFZDNAcGehaltü
gEg gEp gE* gE+ gEv
DAPIcAFZDNAcGehaltü
E
pE +E
oE äE
gEE
ß
Fd es FM
ax im um s gEg gEp gE* gE+ gEv
FSCcAFZGrößeü
gEg gEp gE* gE+ gEv
DAPIcAFZDNAcGehaltü
E
pE +E
oE äE
gEE
ß
Fd es FM
ax im um s gEg gEp gE* gE+ gEv
subGgF
PeakZellc
trümmer
Zellzyklusc
Bereich
Zellc
haufen
AlleFEreignisse
Casp*zy
NachFAusschlussFvon
ZelltrümmernFundFchaufen
VorFAusschlussFvon
ZelltrümmernFundFchaufen
SS
Cc AF
ZG
ra nu lit
ät
ü
gEg
gEp
gE*
gE+
ZellenZellc
trümmer
PopulationWFAlleFEreignisse PopulationWFZellen
DA
PI
cW vEK
oEK
VEK
äEK
:EK
gEEK
weitereFZellc
trümmer
Dublettenn
ZellhaufensubGgF
Bereich
Einzelzellen
Abbildung 3.4. | Abtrennung von Zelltrümmern und -haufen zur korrekten Zellzyklus- und
subG1-Analyse. Abgrenzung des subG1-Peaks von Zelltrümmern in U87 Zellen 20 h nach Apoptoseinduktion mit MG132 und SuperKillerTRAIL.
Signals bei den behandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen, der bestätigte, dass der
Antikörper funktionierte (siehe Abb. 3.3). Die Casp3*-positiven Zellen überlagerten vollständig mit den denen im subG1-Bereich; die meisten Casp3*-positiven Zellen wiesen jedoch noch keine DNA-Fragmentierung auf. Dies zeigte, dass der Anteil der apoptotischen
Zellen leicht unterschätzt werden kann, wenn nur der subG1-Bereich zur Bestimmung herangezogen wird. Dennoch ist die subG1-Messung unerlässlich für die Quantifizierung der
abgeschlossenen Apoptose.
3.1.3. Erweiterte Zellzyklus-Messung
Aufgrund des gleichen DNA-Gehalts ist keine durchflusszytometrische Unterscheidung zwischen Zellen in der G2- und M-Phase möglich, die nur auf einem DNA-Farbstoff basiert. Um
die γH2AX-Expression während der Mitose gesondert zu betrachten, war daher ein zusätzlicher M-Phase Marker erforderlich. Ein solcher Marker war auch für die Auswertung von
Zellzyklusblockaden am G2/M-Übergang wünschenswert. Grundsätzlich deutet ein Anstieg
des G2/M-Peaks im Histogramm eines DNA-Farbstoffs auf einen G2/M-Arrest hin; die Interpretation wird jedoch erschwert, wenn es gleichzeitig zur Apoptose kommt, oder zusätzlich
63
Kapitel 3: Methodenentwicklung
DAPI7AMoDNA7Gehaltn
0
20
40
60
80
100
SuperKillerTRAILM,M G132
x Md es MM
ax im um s 101 102 103 104 105
DAPI7AMoDNA7Gehaltn
0
20
40
60
80
100
Kontrolle
x Md es MM
ax im um s 101 102 103 104 105
Immunfärbung Nicoletti-Färbung
DAPI7AMoDNA7Gehaltn
0
20
40
60
80
100
subG1
20969x
SuperKillerTRAILM,M G132
x Md es MM
ax im um s 101 102 103 104 105
DAPI7AMoDNA7Gehaltn
0
20
40
60
80
100
Kontrolle
x Md es MM
ax im um s 101 102 103 104 105
subG1
0926x
subG1
1985x
subG1
23957x
Abbildung 3.5. | Validierung der subG1-Messung. Analyse von U87 Zellen 20 h nach Apoptoseinduktion mit MG132 und SuperKillerTRAIL. Links: Immunfärbung. Rechts: Referenzmethode nach
Nicoletti. Die Ergebnisse stimmten gut miteinander überein.
Blockaden in anderen Zellzyklusphasen einsetzen. Beispielsweise kann die Überwindung einer G1/S-Blockade auch zu einer temporären Überhöhung des G2/M-Anteils führen, weil
dann kurzfristig mehr Zellen für den Übergang in die nachfolgenden Phasen zur Verfügung
stehen. Ein gleichzeitiger G2-Anstieg und M-Abfall ist hingegen eindeutig (analog verhält es
sich mit G1/S-Blockaden).
Als Marker für die M-Phase wurde ein mit Alexa Fluor 555-konjugierter Phosphohiston-H3
(Ser10) Antikörper (pH3-AK) getestet. Die Phosphorylierung ist für die Chromosomenkondensation notwendig und bleibt während der gesamten Mitose erhalten. Der pH3-AK wurde
zusammen mit den übrigen Antikörpern eingesetzt, so dass kein Extraschritt bei der Färbung erforderlich war. Die pH3-positive Zellen wiesen Signalstärken auf, die um mehr als
eine Dekade größer waren als pH3-negative Zellen (siehe Abb. 3.6, Diagramm 7). Mit einem
Fluoreszenzmikroskop wurde bestätigt, dass die pH3-positiven Zellen mitotisch waren.
3.1.4. Das vollständige Protokoll
Alle Zentrifugationsschritte wurden 5 min bei 7°C und 200x g durchgeführt. Die Zellen wurden in T25-Flaschen (3 Replikate) bestrahlt und nach der gewünschten Reparaturzeit mit
64
Kapitel 3: Methodenentwicklung
1 mL Trypsin-EDTA-Lösung geerntet, mit 3 mL Fixierlösung F gemischt und nach Vereinzelung durch Auf- und Ab-Pipettieren in ein Röhrchen überführt. Das Medium wurde in
separaten Röhrchen (ÜS-Fraktion) zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde in 500µL PBS resuspendiert und mit 1 mL Fixierlösung F gemischt. Die Zellen wurden 10 min bei RT inkubiert, dann zentrifugiert und in 3 mL eiskaltem 70% Ethanol resuspendiert (1 mL bei den
ÜS-Fraktionen). Die Proben wurden auf Eis gesammelt und bis zur Färbung bei 4°C gelagert.
Die ÜS-Fraktionen wurden mit den zugehörigen adhärenten Fraktionen vereinigt. Die Zellen wurden zentrifugiert und nach Entfernen des ÜS in Waschpuffer F (5g·L–1 BSA in PBS)
resuspendiert. Auf diese Weise wurden 3 Waschschritte durchgeführt. Anschließend wurden
die Zellen 1 h lang bei 37°C in 1 mL RNase-Lösung (200µg ·ml–1 RNase A in Waschpuffer F)
inkubiert. Währenddessen wurde AK-Lösung hergestellt, indem γH2AX-AK 1:20, Casp3*-AK
1:20 und pH3-AK 3:200 in AK-Puffer IF (30g·L–1 BSA in PBS) verdünnt wurde. Die Zellen wurden zentrifugiert, nach Entfernen des ÜS mit einer Kolbenhubpipette in 100µL AKLösung resuspendiert und 1 h lang bei RT inkubiert. Ab diesem Schritt wurden die Proben
stets im Dunklen gehalten.
Nach der Inkubation wurden die Proben zentrifugiert, der ÜS wurde mit einer Kolbenhubpipette abgenommen und die Zellen wurden in 250µL DAPI-Färbelösung F (1µg ·ml–1 DAPI
in PBS) resuspendiert. Die Suspensionen wurden durch das Zellsieb im Deckel spezieller
FACS-Röhrchen (BD Falcon) pipettiert und auf Eis gestellt. Zur Messung wurde das Durchflusszytometer LSR II (BD) mit zugeschaltetem UV-Laser benutzt. Die Geräteeinstellungen
sind in Tabelle 3.1 aufgeführt.
Tabelle 3.1. | Einstellungen des LSR II Durchlusszytometers. λ: Wellenlänge, U: Elektrische Spannung, -A: Zeitintegral des Signals, -H: Maximalwert, -W: Signaldauer (von Eintritt des Objekts in den
Laserstrahl bis zum Austritt), FSC: Vorwärtsstreulicht (front scatter), SSC: Seitwärtsstreulicht (side
scatter), Angabe zu den optischen Bandpassfiltern: Mittlere Wellenlänge/Bandbreite in nm.
Parameter Bedeutung Anregungslaser Detektor Messwert
λ (nm) P (mW) Filter U (V) -A -H -W
FSC Größe 488 100 488/10 50 3 3
SSC Granulität 488 100 488/10 50 3 3
Alexa488 γH2AX 488 100 525/50 420 3 3
Alexa555 pH3 561 150 586/15 420 3 3
Alexa647 Casp3* 640 40 670/14 480 3 3
DAPI DNA 350 20 450/50 320 3 3 3
3.1.5. Datenauswertung
Zur Datenauswertung wurde die Software FlowJo 7.6.5 verwendet. Signalüberlagerungen
der unterschiedlichen Fluorophore wurden mit Hilfe der Kompensationsmatrix in Tabelle
3.2 korrigiert (ermittelt anhand einer Leerkontrolle ohne Fluoreszenzfärbung und Einzelfärbungen mit DAPI, γH2AX-AK, pH3-AK oder Casp3*-AK). Die registrierten Ereignisse wurden
anhand ihrer Messwerte in unterschiedliche Populationen (Gates) eingeteilt (siehe Abb. 3.6):
Zelltrümmer und -haufen wurden von der Analyse ausgeschlossen (Zellen und Einzelzellen
Gate), intakte Einzelzellen (Zellzyklus) wurden von Zellen mit fragmentierter DNA (subG1)
65
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Tabelle 3.2. | Kompensationsmatrix für die Durchflusszytometrie. Aus der Matrix geht hervor, wie
stark jedes Fluorophor zum jeweiligen Detektorsignal beiträgt. Die Werte sind so normiert, dass der
Beitrag eines Fluorophors zu seinem vorgesehenen Detektor 100% beträgt.
Signalzusammensetzung
Alexa488-A Alexa555-A Alexa647-A DAPI-A
D
et ek to r Alexa488-A 100 0,12 0,00 0,00
Alexa555-A 1,24 100 0,06 0,04
Alexa647-A 1,93 0,64 100 2,13
DAPI-A 0,03 0,02 0,02 100
unterschieden und einer Zellzyklusanalyse nach dem Dean-Jett-Fox Modell [181,182] unterzogen (DJF). Auf dieser Grundlage wurden die intakten Zellen zunächst in die Phasen G1, S
und G2/M eingeteilt. Das G2/M-Gate wurde weiter unterteilt in pH3-positive mitotische Zellen (M) und G2-Zellen (G2/M ohne M entsprechend der logischen Verknüpfung G2/M ∧M–).
Im Einzelzellen-Gate wurden außerdem Casp3*-positive (Casp3*+) und -negative (Casp3* –)
Zellen unterschieden. Der Grenzwert wurde so gesetzt, dass die Replikate der Kontrollen im
AlexaSFyKAzICaspJNW
g üg
Fg Sg kg Tgg
CaspJNGCaspJN
_
PopulationäzEinzelzellen
5
zd es zM ax im um s J
TgT Tgü TgJ TgF Tg/
Einzelzellen
PopulationäzZellen
DA
PI
KW
DAPIKAzIDNAKGehaltW
/gK
SgK
ygK
kgK
bgK
TggKSgK kgKFgKügKg
üTggK
AllezEreignisse
Einzelzellen
ZellenzITrümmer
_
W
CaspJN
_
CaspJNG
DJF
GürM
GT
M
S
GürMzΛzM
_
M
_
Zellzyklus
subGT
T
ü
J
F
/
S
y Zellen
PopulationäzAllezEreignisse
SS
CK
Az IG
ra nu lit
ät
W
FSCKAzIGrößeW
TgT Tgü TgJ TgF Tg/
TgT
Tgü
TgJ
TgF
Tg/
T
Abbildung 3.6. | FACS-Auswertung: Unterteilung der Subpopulationen. Die Diagramme zeigen
die einzelnen Subpopulationen entsprechend der Hierarchie oben links (Fortsetzung auf Seite 67).
66
Kapitel 3: Methodenentwicklung
100
(
kd es kM ax im um s 100K60K 80K40K20K0
0
20
40
60
80
G2/MSG1
Population:kZellzyklus
DAPIbAk)DNAbGehalt5
6
0
20
40
60
80
M
Population:kZellzyklus
Alexa555bAk)pH35
(
kd es kM ax im um s 100
7
101 102 103 104 105
0
20
40
60
80
100
ZellzyklussubG1
Population:kEinzelzellen
DAPIbAk)DNAbGehalt5
100K60K 80K40K20K0
4
100K60K 80K40K20K0
0
20
40
60
80
100
Population:kZellzyklus
DAPIbAk)DNAbGehalt5
(
kd es kM ax im um s (
kd es kM ax im um s G1
S
G2/M
Summe
DAPIbA
5
Abbildung 3.6. | (fortgesetzt)
Mittel 0,8% positive Zellen aufwiesen. Bei Zeitreihen, die Proben von verschiedenen Tagen
nach Bestrahlung einschlossen, gab es zu jedem Tag eigene Kontrollen und einen angepassten
Grenzwert. Die statistische Auswertung der Daten wurde mit Excel durchgeführt. Aufgrund
der großen Datenmengen wurde hierzu eine Auswertungsvorlage erstellt.
Die γH2AX-Intensität wurde auf den DNA-Gehalt in den einzelnen Zellzyklusphasen normiert, indem der Median in der S-Phase durch 1,5 und in der G2- und M-Phase durch 2,0 geteilt wurde. Der Anteil der einzelnen Zellzyklusphasen an allen intakten Einzelzellen wurde
derart korrigiert, dass die Summe 100% ergab, ohne die Anteils-Verhältnisse zu verschieben;
das Dean-Jett-Fox-Modell lieferte je nach Güte der Anpassung an die experimentellen Daten
kleine Abweichungen (in der Regel betrug die Summe der Rohwerte mindestens 97%).
3.2. HCS Mikroskopie
Das Protokoll für die Immunfärbung von γH2AX wurde für die routinemäßige Anwendung
der High content screening (HCS) Mikroskopie optimiert. Es wurde getestet, wie stark sich
verschiedene Protokollabwandlungen auf die Messergebnisse auswirken, um ein möglichst
einfaches und robustes Protokoll für einen gesteigerten Durchsatz zu erarbeiten. Außerdem
wurden Softwarelösungen zur effizienten Auswertung der Messdaten entwickelt.
67
Kapitel 3: Methodenentwicklung
3.2.1. Protokollabwandlungen der Immunfärbung und ihr Einfluss auf die
Messergebnisse
Tabelle 3.3 enthält die getesteten Abwandlungen und beobachteten Effekte gegenüber dem
Standardprotokoll in Abschnitt 2.5.4. Die Tests wurden mit U87 Zellen 30 min nach Bestrahlung mit 1 Gy Photonen im Vergleich zu unbestrahlten Proben durchgeführt.
Tabelle 3.3. | Protokollabwandlungen. Zur Optimierung der Immunfärbung für HCS Mikroskopie
wurden die folgenden Änderungen gegenüber dem Standardprotokoll in Abschnitt 2.5.4 getestet.
# Abwandlung gegenüber Standardprotokoll Ergebnis
1 Standardprotokoll (keine Abwandlung) —
2 Waschen ohne Tween 20 (nur PBS) etwas weniger Hintergrund im Zytoplasma,
deutlich größere Zellkerne (Fläche anhand
DAPI-Färbung ∼40% größer)
3 Blockierung mit 5mg·mL–1 BSA in PBS statt
30mg·mL–1
mehr Hintergrund im Zytoplasma
4 Permeabilisierung 15 min mit 90% Methanol,
auf -20°C vorgekühlt
sehr ähnlich wie beim Standardprotokoll
5 Fixierung 30 min und ohne Saccharose in der
PFA-Lösung
etwas weniger Hintergrund im Zytoplasma,
Färbung von Zelle zu Zelle jedoch uneinheitlicher
6 Blockierung mit 30mg·mL–1 BSA in PBS und
zusätzlich 0,1% Triton-X 100
etwas weniger Hintergrund im Zytoplasma,
Foci jedoch diffuser
Die einzelnen Messergebnisse sind in den Abbildungen 3.8 und 3.7 dargestellt. Das Signal
des Primärantikörpers (1°AK) wurde im grünen Kanal gemessen, das des Sekundärantikörpers (2°AK) im roten und das DAPI-Signal im blauen Kanal.
0
25
50
75
100
50-59 90-99 130-139 170-179
Ku m ul at iv eµ
uf ig ke itµ
(G
)
Zellkernflächeµ(µm²)
Blauer Kanal (DAPI)
1
2
3
4
5
6
Ktr. 1µGy
a 0
20
40
60
80
100
120
M
ed ia n3 de r3Z
el lk er nf lä ch e3
m ²)
Blauer Kanal (DAPI)
Ktr.
13Gy
1 2 3 4 5 6
Protokollabwandlung
b Abbildung 3.7. | Einfluss der Protokollabwandlungen auf die Zellkerngröße. (a) Kumulierte Häufigkeit und (b) Mediane der Zellkernfläche anhand der DAPI-Färbung in bestrahlten (1 Gy) und unbestrahlten (Ktr.) U87 Zellen. Protokollabwandlungen gemäß Tabelle 3.3.
68
Kapitel 3: Methodenentwicklung
0
5
10
15
20
25
M
ed ia nb de rbF
ok us za hl bp ro bZ el lk er n Grüner Kanal (1°AK)
Ktr.
1bGy
1 2 3 4 5 6
Protokollabwandlung
a 0
5
10
15
20
25
M
ed ia nb de rbF
ok us za hl bp ro bZ el lk er n Roter Kanal (2°AK)
Ktr.
1bGy
1 2 3 4 5 6
Protokollabwandlung
b M
ed ia n de r G
es am tin
te ns itä
t i
m Z
el lk er n 0
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6
Protokollabwandlung
c 0
20
40
60
80
100
120
140
M
ed ia n de r G
es am tin
te ns itä
t i
m Z
el lk er n 1 2 3 4 5 6
Protokollabwandlung
d Abbildung 3.8. | Einfluss der Protokollabwandlungen auf das Ergebnis der γH2AX-Färbung. (a,
b)Mediane der Fokusanzahl und (c, d) Gesamtintensität im Zellkern in bestrahlten (1 Gy) und unbestrahlten (Ktr.) U87 Zellen bei Protokollabwandlungen gemäß Tabelle 3.3. (a) und (c) zeigen Messergebnisse im grünen Kanal (Primär-Antikörper), (b) und (d) im roten Kanal (Sekundär-Antikörper).
Die Protokollabwandlungen hatten nur geringfügigen Einfluss auf die Spezifität der Signale. Als vorteilhaft erwies sich, die Waschschritte mit PBS ohne Tween 20 durchzuführen
(2), die BSA-Konzentration im IF-Puffer bei 30mg·mL–1 zu belassen (3) und kein Triton-X
100 beizufügen (6). Waschen mit reinem PBS zog mitunter Benetzungsprobleme nach sich,
die sich durch Zugabe von 5 g·L–1 vermeiden ließen. Eine zu lange Fixierungsdauer erwies
sich als ungünstig, die Zugabe von Saccharose zur Fixierlösung (soll Schrumpfen der Zellen
vermeiden) schien jedoch keinen Einfluss auf die Zellkerngröße zu haben, und war entbehrlich (5). Die alkoholische Permeabilisierung veränderte die Qualität der Färbung nicht, bot
aber die Möglichkeit Proben über längere Zeit zu lagern und bei Bedarf Proben zu sammeln und gemeinsam zu färben (4). Darüber hinaus stellte sich heraus, dass die Fluoreszenz
des γH2AX-Primärantikörpers trotz geringerer Intensität gegenüber dem Signal des 2°AK eine sensiblere Unterscheidung zwischen bestrahlten und unbestrahlten Proben ermöglichte.
69
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Durch Verzicht auf die Sekundärfärbung konnte die Durchführung erheblich erleichtert und
verkürzt werden. Anhand dieser Ergebnisse wurde das nachfolgende Protokoll mit optimiertem Durchsatz für die HCS Mikroskopie erstellt.
3.2.2. Das optimierte Protokoll
Die Zellen wurden 10 min mit 3% PFA/PBS fixiert, kurz mit PBS gespült und in eiskaltes
70% Ethanol überführt (Lagerung bei 4°C in abgedichtetem Behälter möglich, mindestens
30 min Inkubation). Die Proben wurden in PBS rehydratisiert und anschließend 3x 10 min
mit 5 g·L–1 BSA/PBS (Waschpuffer F) gewaschen. Die 1°AK-Inkubation erfolgte ÜN bei 4°C
mit 1:100 verdünntem γH2AX-Antikörper in 30mg·mL–1 BSA/PBS (AK-Puffer IF) in einer
feuchten Kammer. Es wurden 100µL Lösung pro Pipettierfeld aufgetragen. Es folgten 4x
10 min Waschschritte mit Waschpuffer F. Anschließend wurden die Proben kurz in deionisiertem Wasser geschwenkt und zur Färbung der Zellkerne für 10 s in 1µg ·ml–1 DAPI getaucht.
Schließlich wurden die Präparate mit Fluoromount G eingedeckelt und nach dem Trocknen
bei 4°C aufbewahrt.
3.2.3. Datenauswertung
Die Messergebnisse wurden als Tabellen im Textformat exportiert und zur statistischen Auswertung in Microsoft Excel eingelesen. Eine manuelle Auswertung ist jedoch sehr mühsam
und zeitaufwändig, wenn viele Parameter und/oder Präparate auszuwerten sind. Deshalb
wurde die komplette Datenauswertung mit Excel durch das Makro Histograph automatisiert,
das in Visual Basic for Applications (VBA) geschrieben wurde. Es diente zunächst dazu für
alle geöffneten Metafer-Tabellen die Häufigkeitsverteilungen und kumulativen Häufigkeiten
zu einem beliebig auswählbaren Messparameter zu berechnen und in einem gemeinsamen
Diagramm aufzutragen. Anhand der kumulativen Häufigkeit (Summenfunktionen) lässt sich
auf einen Blick erkennen, wie gut sich die Messwertverteilungen von Replikaten miteinander
decken, und wie deutlich sich unterschiedliche Probengruppen voneinander unterscheiden.
In der Endfassung des Makros werden auch die arithmetischen Mittelwerte und die Mediane der Verteilungen berechnet und in zwei separaten Säulendiagrammen dargestellt. Falls
Replikate vorhanden sind, werden ihre Werte automatisch gemittelt und zusammen mit ihren
Standardabweichungen aufgetragen. Damit dies gelingt, müssen die Tabellen zusammengehöriger Proben unmittelbar nacheinander in Excel geöffnet werden und nach dem Muster
Gruppe-Replikat.txt benannt sein, d.h. die Bezeichnung der Probengruppe und der Replikate muss durch einen Bindestrich getrennt sein. Dies impliziert, dass kein Bindestrich in der
Gruppenbezeichnung vorhanden sein darf; Replikatbezeichnungen unterliegen nicht dieser
Restriktion, jedoch sollte eine schlichte Nummerierung in den meisten Fällen genügen.
Zur Auswahl des auszuwertenden Parameters muss nur die Überschrift in der entsprechenden Spalte ausgewählt werden, wobei es keine Rolle spielt, in welcher der Tabellen die
Auswahl getroffen wird – die Bearbeitungsreihenfolge entspricht immer der Reihenfolge, in
der die Dateien geöffnet wurden. Das Makro wird durch Anklicken einer Schaltfläche gestartet, die sich in die Schnellstartleiste oder eine separate Symbolleiste von Excel integrieren
lässt. Mit Histograph lassen sich nicht nur Metafer-Tabellen auswerten, sondern ganz allgemein Messreihen, die in Spalten organisiert sind. Neben dem oben beschriebenen Einlesen
der Spalten aus verschiedenen Dateien, können auch Excel-Arbeitsblätter verwendet werden,
70
Kapitel 3: Methodenentwicklung
die mehrere Tabellen enthalten. Dabei gelten die gleichen Bedingungen für die Reihenfolge
ihrer Anordnung und das Muster ihrer Benennung, wie beim Öffnen mehrerer Dateien. Mit
dieser Einlesevariante wurden z.B. auch Daten weiter ausgewertet, die durch superauflösende Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden (siehe Abschnitte 3.4.7 und 3.4.8).
Neben Histograph wurden einige weitere Makros für Excel implementiert, die den Umgang mit großen Datenmengen erleichtern. Mit ihnen lassen sich beispielsweise Tabellen aus
mehreren Dateien schnell in einem Dokument zusammenfassen und Berechnungen in einer
neuen Spalte auf alle Einzeltabellen übertragen. Hierdurch können auf einfache Weise Parameter ausgewertet werden, die sich aus mehreren Messgrößen zusammensetzen. Auch die
Zusammenfassung mehrerer gleichartiger Messreihen zu einer Gruppen-Messreihe ist möglich.
3.3. Kombination von Durchflusszytometrie und HCS Mikroskopie
Um die knappe Strahlzeit, den Aufwand und Kosten zu minimieren, wurde nach einer Möglichkeit gesucht, die für die Durchflusszytometrie gefärbten Proben parallel zur mikroskopischen Auswertung zu nutzen. Dazu war es erforderlich, nach der Färbung ein Aliquot der
Zellen auf einen Objektträger (OT) oder ein Deckglas (DG) aufzubringen und mit einem geeigneten Eindeckmedium ein mikroskopisches Präparat herzustellen. Fluoromount-G hatte
sich als Eindeckmedium für die verwendeten Fluorophore bewährt (siehe Abschnitt 3.4.1)
und sollte beibehalten werden. Aufgrund der hohen Viskosität von Fluoromount-G ließ sich
die Zellsuspension jedoch nicht ohne Weiteres mit dem Eindeckmedium mischen (es kam zu
Phasengrenzen oder dem Einschluss kleiner Luftblasen).
Die Zellen mussten deshalb zunächst auf der Glasoberfläche immobilisiert werden. Hierzu
wurde ein spezieller Zentrifugeneinsatz (Zytospin) getestet, mit dessen Hilfe Zellen durch
Zentrifugieren auf OT aufgebracht werden können. Das System erwies sich jedoch als zu
aufwändig und zeitintensiv zur Verarbeitung einer größeren Probenstückzahl. Stattdessen
wurden die Zellen auf DG luftgetrocknet. Hierbei kam es auf ein geeignetes Volumen der
Zellsuspension an: war es zu groß, so entstanden Zellhaufen und die Zellen hafteten nicht
gut an; war es zu klein, so ließen sich die Zellen nicht gut auf den DG verteilen. Zu geringe
Zelldichten führten ebenfalls zu Benetzungsproblemen. Letztlich wurden ca. 1 ·105 Zellen in
20µL auf 24x24 mm DG pipettiert, mit der Pipettenspitze verteilt und ÜN im Dunkeln bei RT
getrocknet. Anschließend wurden die DG mit einem linsengroßen Tropfen Fluoromount-G
benetzt und luftblasenfrei auf OT aufgelegt. Nach dem Gelieren des Eindeckmediums wurden die Präparate bei 4°C aufbewahrt.
Die so hergestellten Präparate eigneten sich für die Auswertung mit dem HCS-Mikroskop.
Sie wiesen eine klare und starke Fluoreszenzfärbung auf, zeigten jedoch im Vergleich zu
den rein für die Mikroskopie hergestellten Präparaten (gemäß Abschnitt 3.2.2) ein leicht
erhöhtes Autofluoreszenzniveau und waren weniger bleichstabil. Für die superauflösende
Lokalisationsmikroskopie konnten sie nicht eingesetzt werden.
3.4. Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Im Rahmen einer Kooperation aus der Abteilung Ophthalmologie des Amyloidose-Zentrums
der Universitätsklinik Heidelberg (Prof. Dr. Stephan Dithmar) und der AG Biophysik der Ge71
Kapitel 3: Methodenentwicklung
nomstruktur im Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie der Universität Heidelberg (Prof. Dr. Dr. Christoph Cremer) wurde von Gerrit Best und Sabrina Rossberger ein
neuartiges Mikroskop gebaut, das erstmals eine direkte Kombination von Strukturierter Beleuchtung (SIM) und Lokalisationsmikroskopie (SPDM) erlaubte [154]. Der Aufbau des Mikroskops ist in Abbildung 3.9 dargestellt. Es verfügt über einen Strahlengang zur Erzeugung
und Manipulation der strukturierten Beleuchtung mit Hilfe eines Twyman-Green Interferometers (SIM-Modus), und einen alternativen Strahlengang mit homogener Ausleuchtung.
Welcher Strahlengang verwendet wird, kann durch Umklappen zweier Spiegel gewählt
werden. Durch geeignete Wahl eines Graufilters kann die Beleuchtungsintensität variiert
werden, so dass das Gerät bei homogener Ausleuchtung mit geringer Intensität als normales Auflichtmikroskop (Weitfeld-Modus) oder bei hoher Intensität als Lokalisationsmikroskop
(SPDM-Modus) betrieben werden kann. Zur Beleuchtung konnte zum Zeitpunkt dieser Arbeit zwischen 3 Lasern mit den Wellenlängen 404 nm, 488 nm und 568 nm gewählt werden.
Alle Funktionen des Mikroskops können computergestützt durch eine mit Python programmierte Software gesteuert werden.
A
Laser
Webcam
CCDIKamera
Objektiv
PiezoI
Shutter
Twyman(Green
Interferometer
Apertur(
blendeλ/2(Plätt(
chenI
SIMIStrahl(
aufweiterI
SPDMIStrahl(
aufweiterI
B
FokuslinseI
Tubus(
linseI
Laser(Blockier(
filterIDichromatischerISpiegelIäWahlradMI
Graufilter
WahlradII
Modus(WahlspiegelI
Modus(WahlspiegelI
Probe
DeckglasImitIProbe
Objektträger
Objektiv
optischeIAchseIäzM
Abbildung 3.9. | Aufbau des SIM-SPDM Kombimikroskops. Durch Umklappen der Modus-Wahlspiegel A und B kann zwischen SIM (blauer Strahlengang) und homogener Beleuchtung (Weitfeldbzw. SPDM-Modus, grüner Strahlengang) gewechselt werden. Das Twyman-Green Interferometer erzeugt die strukturierte Beleuchtung im SIM-Modus. Es verfügt über Stellantriebe zum Rotieren und
Verschieben der Phase des Interferenzmusters. Mit dem vorangestellten λ/2-Plättchen werden dabei
entstehende Polarisationseffekte ausgeglichen. Die Webcam nimmt ein Livebild des Interferenzmusters auf, das zur Kalibrierung der Stellantriebe dient. Die unbeschrifteten Elemente sind fest installierte
Spiegel. Das Inlay oben rechts zeigt wie das Präparat einzulegen ist. Quelle: modifiziert nach [154].
Zur Gewährleistung optimaler Ergebnisse beim Einsatz des Mikroskops waren einige Anforderungen an die Probenpräparation zu berücksichtigen. Insbesondere musste gewährleistet werden, dass die Fluorophore während den relativ langwierigen SIM-Aufnahmen bei normaler Beleuchtungsintensität kaum ausbleichten, im SPDM-Modus mit hoher Beleuchtungsintensität jedoch ein schnelles reversibles Bleichen (günstiges Blinkverhalten) zeigten.
72
Kapitel 3: Methodenentwicklung
3.4.1. Einfluss verschiedener Eindeckmedien auf das Bleich- und Blinkverhalten
der Fluorophore
Da die chemische Umgebung der Fluorophore das Bleich- und Blinkverhalten der Fluorophore maßgeblich beeinflusst, wurden verschiedene Eindeckmedien auf ihre Eignung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.4 zusammengefasst.
Tabelle 3.4. | Einfluss verschiedener Eindeckmedien auf das Bleich- und Blinkverhalten der Fluorophore Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647. WF: im Weitfeldmodus (geringe Beleuchtungsintensität).
LM: im SPDM-Modus (hohe Beleuchtungsintensität zur Anregung des Blinkens).
Beobachtungen
Eindeckmedium Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 647
Fluoromount-G
(Southern Biotech)
WF: klar erkennbare Foci, wenig
Hintergrund.
LM: schnelles Ausbleichen, gefolgt
von regem, hellem Blinken, das
nach einiger Zeit seltener auftritt.
Oft dauern einzelne Blinkereignisse
einige hundert ms, während denen
Helligkeitsschwankungen zu beobachten sind.
WF: klar erkennbare Foci, wenig
Hintergrund.
LM: schnelles Ausbleichen ohne
Blinken
Immu-Mount
(Thermo Scientific
Shandon)
WF: starkes Leuchten der Plasmamembran, das die Foci im Kern
überlagert.
LM: schnelles Ausbleichen, gefolgt
von regem Blinken, das auch nach
langer Belichtungszeit anhält. Die
Blinkereignisse sind typischerweise
sehr hell und kurz (< 100 ms).
WF: starkes Leuchten der Plasmamembran, das die Foci im Kern
vollkommen überdeckt.
LM: schnelles Ausbleichen ohne
nennenswertes Blinken
Switching Buffer* WF: schwache Signale, die von Hintergrundfluoreszenz überlagert werden.
LM: schnelles Ausbleichen ohne
Blinken
WF: klar erkennbare Foci, wenig
Hintergrund.
LM: schnelles Ausbleichen, gefolgt
von regem Blinken, das auch nach
langer Belichtungszeit anhält. Die
Blinkereignisse dauern typischerweise einige hundert ms.
SB–* WF: klar erkennbare Foci, wenig
Hintergrund.
LM: schnelles Ausbleichen ohne
Blinken
WF: klar erkennbare Foci, wenig
Hintergrund.
LM: schnelles Ausbleichen, gefolgt
von regem Blinken, das auch nach
langer Belichtungszeit anhält. Die
Blinkereignisse dauern tendenziell
kürzer als bei Verwendung von Switching Buffer.
MEA-Eindeckmedium*
WF: klar erkennbare Foci, wenig
Hintergrund.
LM: schnelles Ausbleichen ohne
Blinken
WF: schwache Signale mit schlechtem Signal/Rausch-Verhältnis.
LM: relativ helles Blinken, auch
nach langer Belichtungszeit. Einzelne Blinkereignisse dauern typischerweise ∼100 – 300 ms.
*Herstellung siehe Abschnitt 2.5.3; da es sich um dünnflüssige Eindeckmedien handelt, wurden die Präparate
mit Nagellack versiegelt.
73
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Alexa Fluor 647 zeigte ein gutes Blinkverhalten in Switching Buffer, SB– und MEA-Eindeckmedium, jedoch nicht in Fluoromount-G. Für Alexa Fluor 488 verhielt es sich umgekehrt, so
dass diese Fluorophorkombination keine Lokalisationsaufnahmen für 2 Kanäle erlaubte. Immumount kam aufgrund des starken unspezifischen Leuchtens der Plasmamembran nicht in
Frage. Fluoromount-G erwies sich im Hinblick auf die SIM-Anforderungen dank des geringen Bleichens im Weitfeldmodus als geeignetster Kompromiss und wurde daher weiterhin
verwendet.
3.4.2. Optimierung und Erweiterung der Immunfluoreszenz-Färbung
Um eine hohe Signalstärke und -spezifität zu gewährleisten, wurde die Immunfärbung von
γH2AX für die superauflösende Mikroskopie optimiert. Außerdem wurde sie um die Anfärbung von Phospho-BRCA1 (Ser1524), kurz pBRCA1, erweitert. Es handelt sich dabei um
die aktivierte Form eines DSB-Reparaturenzyms aus der Homologen Rekombination (siehe
Abschnitt 1.5.1 in der Einleitung).
Die Signalstärke und Bleichstabilität konnte durch den Einsatz von Sekundärantikörpern
(2°AK) ausreichend verstärkt werden. Im Falle der γH2AX-Färbung war dieser gegen Maus
IgG gerichtet, und wie der Primärantikörper (1°AK) mit Alexa Fluor 488 Fluorophoren gekoppelt (AF488-Anti-Maus AK); der pBRACA1 2°AK band spezifisch an IgG aus dem Kaninchen
und war mit Alexa Fluor 594 markiert (AF594-Anti-Kaninchen AK). Zur Verbesserung der
Spezifität der 2°AK Bindung, und zur Verminderung von Autofluoreszenz, wurden die Präparate vor der eigentlichen Immunfärbung mit Image-iT FX Signal Enhancer (Invitrogen) behandelt. Gegenüber der herkömmlichen Färbung ermöglichte dies den Einsatz von erheblich
größeren Antikörpermengen, und somit einer wesentlich höheren Fluorophordichte, ohne
Zunahme von unspezifischer Hintergrundfluoreszenz (siehe Abb. 3.10). Die optimalen Konzentrationen für Primär- und Sekundärantikörper wurden mit Hilfe von Verdünnungsreihen
in Vorversuchen festgelegt.
3.4.3. Das optimierte Protokoll
DG mit Zellen wurden aus dem Medium entnommen, mit 2 mL PBS gespült, und 15 min
lang mit 3% PFA in PBS fixiert. Anschließend wurden die DG mit 2 mL PBS gespült und mit
70% Ethanol (vorgekühlt auf –20°C) mindestens 60 min inkubiert, oder für längere Zeit bei
4°C gelagert. Die DG wurden in eine Färbekammer überführt und zur Rehydratisierung und
Entfernung des Alkohols über einen Zeitraum von 40 min 3x mit 100 mL PBS gewaschen.
Danach wurden die Zellen auf den DG mit einem Tropfen Image-iT FX Signal Enhancer
(Invitrogen) auf einer Lage Parafilm benetzt, und in einer feuchten Kammer 30 min lang bei
RT inkubiert.
Es folgten 3x 5 min Waschschritte mit Waschpuffer F (5 g·L–1 BSA in PBS). Während den
Waschritten wurde die 1°AK-Lösung vorbereitet. Dazu wurde der γH2AX-AK (Maus) 1:100
und der pBRCA1-AK (Kaninchen) 1:500 in AK-Puffer IF (30 mg·mL–1 BSA in PBS) verdünnt.
Die DG wurden ÜN mit 50µL AK-Lösung auf Parafilm in einer feuchten Kammer bei 4°C
inkubiert. Am nächsten Tag wurden die DG 3x 5 min mit Waschpuffer F gewaschen und die
2°AK wurden in AK-Puffer IF verdünnt: AF488-Anti-Maus AK wurde 1:250 eingesetzt und
AF594-Anti-Kaninchen AK 1:1000. Die Sekundärfärbung erfolgte wie zuvor mit 50µL AKLösung auf Parafilm. Die Inkubation wurde 90 min bei RT durchgeführt.
74
Kapitel 3: Methodenentwicklung
10 µm 10 µm
ohne AK AF488-Anti-Maus AK 1:250
Si gn al E
nh an ce r Si gn al E
nh an ce r a 10 µm 10 µm
ohne AK AF549-Anti-Kaninchens AK 1:1000
Si gn al E
nh an ce r Si gn al E
nh an ce r b Abbildung 3.10. | Optimierung der Immunfärbung für 3D-SIM. Unbestrahlte U87 Zellen wurden mit oder ohne den Blockierungsschritt mit Image-iT FX Signal Enhancer präpariert (+/– Signal
Enhancer). Die 1°AK-Inkubation wurde ausgelassen, so dass die Aufnahmen rechts neben den Abbildungen der Zellkerne (DAPI-Kanal) ausschließlich Autofluoreszenz und unspezifische Bindungen des
2°AK zeigen. Die Belichtungszeit wurde aufgrund der schwachen Fluoreszenz sehr lang gewählt (grüner Kanal: 5 s, roter Kanal: 2 s) und lag somit um ein Vielfaches höher als bei normalen Präparaten.
(a) grüner Kanal (AF488-Anti-Maus AK), (b) roter Kanal (AF594-Anti-Kaninchen AK).
Die DG wurden abermals 3x 5 min mit Waschpuffer F gewaschen, kurz in deionisiertem
Wasser geschwenkt, und zur Gegenfärbung der Zellkerne 15 min mit 50µL DAPI-Färbelösung
M (1µg ·ml–1 DAPI) bei RT auf Parafilm inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde überschüssige DAPI-Lösung durch Schwenken der DG in deionisiertem Wasser entfernt, und die
DG wurden mit einem linsengroßen Tropfen Fluoromount-G auf Objektträgern eingebettet.
Die Präparate wurden bei RT luftgetrocknet und dann bei 4°C gelagert.
In Vorversuchen zeigte sich, dass die γH2AX-Färbung während der SIM-Aufnahme kaum
ausbleichte (siehe Abb. 3.14b in Abschnitt 3.4.7), so dass es möglich war im Anschluss eine
Lokalisationsaufnahme derselben Zelle anzufertigen (siehe nächster Abschnitt).
75
Kapitel 3: Methodenentwicklung
3.4.4. Aufnahmesequenz am SIM-SPDM Kombimikroskop
In der vorliegenden Arbeit wurde die erste große Versuchsreihe mit dem SIM-SPDM Kombimikroskop durchgeführt: Mit Hilfe des optimierten Protokolls zur Immunfärbung aus Abschnitt 3.4.2 wurden DSB-Reparaturfoci in U87 Zellen untersucht, die zu verschiedenen Zeitpunkten (15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 26 h) nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen am SNAKE fixiert worden waren (zur Durchführung der Bestrahlung siehe Abschnitt 2.3). Von jedem
Zeitpunkt, sowie einem Kontrollpräparat mit unbestrahlten Zellen, wurden mindestens 15
Zellen aufgenommen.
Außerdem wurden zwei weitere Präparate mit bestrahlten Zellen eingeschlossen, von denen je 5 Zellen aufgenommen wurden: bei einem wurde die pBRCA1-Färbung weggelassen
(γH2AX-Einzelfärbung), beim Anderen fehlte die γH2AX-Färbung (pBRCA1-Einzelfärbung).
Diese Proben dienten zur Beurteilung bzw. Kompensation eventueller Signalüberlagerungen
der beiden Immunfluoreszenzfärbungen; es konnten keine nennenswerten Störeffekte dieser
Art festgestellt werden (siehe Abb. 3.11).
pBRCA1 Einzelfärbung
5 µm
56
8
nm L
as er 48
8
nm L
as er H2AX Einzelfärbung
Abbildung 3.11. | Kontrolle von Signalüberlappungen bei der SIM-Aufnahme. Die pBRCA1Einzelfärbung (links) zeigte kein nennenswertes Signal im γH2AX-Kanal (unten); umgekehrt wurde
bei der γH2AX-Einzelfärbung (rechts) keine Signalüberlappung mit dem pBRCA1-Kanal (oben) festgestellt. Gezeigt sind die Summenbilder aller Aufnahmen zu einer Z-Position im jeweiligen Kanal; sie
sind übersättigt dargestellt, damit auch sehr schwache Signale erkennbar sind.
Die verwendete Aufnahmesequenz ist in Tabelle 3.5 spezifiziert. Das Interferenzmuster der
Beleuchtung im SIM-Modus bestand aus sinusförmigen Helligkeitsschwankungen, die wie
ein Gitter parallel verlaufende Beleuchtungsstreifen bildeten (siehe Abb. 3.12). Die Gitterkonstante des Beleuchtungsmusters (Abstand zwischen 2 Helligkeitsmaxima) betrug 350 nm
im Falle des 488 nm Lasers und 400 nm für den 568 nm Laser. Im SIM-Modus wurden 3DAufnahmen der Zellen erstellt, indem das Objektiv in 200 nm Schritten entlang der optischen
Achse (Z-Achse) verschoben wurde.
Zu jeder Z-Position wurden 9 Bilder aufgenommen, die sich aus Aufnahmen bei 3 verschiedenen Rotationswinkeln mal 3 Phasenverschiebungen des Beleuchtungsmusters ergaben. Die
Rotationswinkel betrugen 0° (senkrechte Streifen auf dem Kamerabild), 60° und -60°, und die
Phasenverschiebungen 0°, 120° und 240°. Nach Aufnahme dieser Bilderserie mit dem 568 nm
76
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Tabelle 3.5. | Aufnahmesequenz am SIM-SPDM Kombimikroskop. Reihenfolge und Aufnahmeparameter der unterschiedlichen Beleuchtungsmodi. Verschiedene Kanäle sind farblich hervorgehoben.
# Beleuch- Färbung/Anregungs- Aufnahme- Integrations- Laserleistung (mW)*/
tung wellenlänge (nm) modus zeit (ms) Graufilter (% Transm.)
1 SIM pBRCA1/568 3D 200 100/∼1.56
γH2AX/488 3D 200 100/∼0.02
2 Weitfeld DAPI/404 3D 500 200/100
3 Weitfeld DAPI/404 2D 500 200/100
4 SPDM γH2AX/488 2D Zeitreihe 100 100/100
(2000 Bilder)
5 Weitfeld DAPI/404 2D 500 200/100
*Es treten Leistungsverluste durch die optischen Elemente zur Strahlformung auf (vor allem im SIM-Modus), so
dass die Beleuchtungsleistung kleiner war als die allein durch den Graufilter geminderte Laserleistung.
Laser (pBRCA1-Färbung) wurde die Prozedur mit dem 488 nm Laser (γH2AX-Färbung) wiederholt, und alle Aufnahmen wurden gemeinsam als 3D Bildstapel in eine Datei im Khoros
Datenformat (KDF) abgespeichert.
Aufgrund der geringen Kohärenzwellenlänge des UV-Lasers, und seiner mäßigen Eignung
für den verwendeten Anregungsfilter, konnte die Zellkernfärbung mit DAPI nicht im SIMModus aufgenommen werden. Deshalb wurde im Anschluss an die SIM-Aufnahme ein 3DBild des Zellkerns im Weitfeldmodus aufgenommen, das später entfaltet wurde (siehe Aba b
c Abbildung 3.12. | SIM Beleuchtungsmuster und Aufnahmesequenz. (a) Durch Interferenz wurden
sinusförmig modulierte Helligkeitsstreifen mit festgelegter Gitterkonstante erzeugt. (b) Die Modulationsrichtung des Gitters (siehe Pfeile) wurde um 0°, 60° und –60° rotiert. (c) Die Phase wurde jeweils
um 0°, 120° und 240° verschoben, so dass sich in der Summe eine homogene Beleuchtung ergab. Pro
Aufnahmekanal resultierten 9 Bilder von jeder Z-Position. Zuerst wurde die Phase variiert, dann die
Z-Position, die Gitterrotation und schließlich der Kanal.
77
Kapitel 3: Methodenentwicklung
schnitt 3.4.5). Die zusätzlichen 2D DAPI-Bilder vor und nach der SPDM-Aufnahme (an gleicher Z-Position) dienten der Berechnung eines Driftvektors zur Korrektur eventueller Verschiebungen des Objekttisches während der SPDM-Aufnahme. Zur Driftkorrektur während
der SIM-Aufnahmen waren aufgrund der besonderen Aufnahmesequenz keine zusätzlichen
Korrekturbilder erforderlich (siehe Abschnitt 3.4.5).
3.4.5. Auswertealgorithmen
Zur Auswertung der Aufnahmen wurden diverse Algorithmen in MATLAB implementiert, die
sich in die Aufgabenfelder Rekonstruktion, Korrektur, Visualisierung und Analyse einteilen
lassen (siehe Tab. 3.6). Es gibt allgemeine Funktionen, Funktionen für spezielle Aufnahmetypen, und solche, die der Kombination von SPDM- und SIM-Aufnahmen dienen. Eine
vollständige Liste mit detaillierten Funktionsbeschreibungen befinden sich in Anhang A.1.
Für größtmögliche Flexibilität wurden die Funktionen modular angelegt, d.h. es gibt Kernfunktionen, die von spezialisierteren Funktionen benutzt werden, um komplexere Aufgaben
zu lösen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Automatisierung von Prozessschritten
gelegt; deshalb wurden alle wesentlichen Funktionen so angelegt, dass sie nicht nur für einzelne Aufnahmen ausgeführt werden können, sondern auch für alle Aufnahmen im selben
Ordner, oder in allen Unterordnern eines bestimmten Pfads. Um dies zu ermöglichen, weisen viele Funktionen eine Standardschnittstelle auf, so dass sie von Erweiterungsfunktionen
zur Stapelverarbeitung aufgerufen werden können, die im Folgenden als Batchfunktionen
bezeichnet werden.
Als Standardschnittstelle wurden die ersten 3 Eingabeargumente auf die Variablen inPath,
fnPattern und outPath festgelegt. Sie definieren den Pfad eines Quellordners, ein oder mehrere Namensmuster zur Erkennung der zu bearbeitenden Dateien, und einen Ausgabeordner.
Darüber hinaus benötigen einige der erweiterbaren Funktionen zusätzliche Argumente; diese
werden von den Batchfunktionen als varargin (MATLAB-spezifische optionale Variablenliste
flexibler Länge) aufgenommen und zu den erweiterbaren Funktionen durchgereicht.
Die Batchfunktionen arbeiten mehrere Aufnahmen nacheinander ab und übergeben sie
der zu erweiternden Funktion. Außerdem protokollieren sie den Verlauf des Vorgangs, sowie
eventuell aufgetretene Fehler, und fassen teilweise Ergebnisse einzelner Bearbeitungsschritte zusammen. Diese Zusatzinformationen werden in separaten Dateien abgelegt, die dem
Experimentator als Kontrolle dienen und in einigen Fällen für nachfolgende Schritte zur
Bildauswertung benötigt werden (Details hierzu sind der Dokumentation der Funktionen im
Anhang unter A.1 zu entnehmen). Es wurden allgemeine Batchfunktionen implementiert,
mit denen sich mehrere Funktionen erweitern lassen, und solche, die für spezielle Funktionen und Aufgaben vorgesehen sind.
3.4.6. Entfaltung der 3D-Weitfeld-Aufnahmen
Die 3D-Aufnahmen der Zellkerne (DAPI-Färbung) im Weitfeldmodus wurden mit der Funktion Deconvolve entfaltet. Ihre Batchfunktion DeconvolveDir startet die Entfaltung aller
Aufnahmen innerhalb eines Dateiordners; sie kann wiederum mit BatchFolders erweitert
werden, um mehrere Ordner auf einmal zu bearbeiten. Die eigentliche Entfaltung wird von
der Funktion GenericDeconvolution von Rainer Heintzmann durchgeführt. Dabei wird eine simulierte Punktbildfunktion (PSF) zu Grunde gelegt, die anhand der charakteristischen
78
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Tabelle 3.6. | Algorithmenübersicht. Einteilung der wichtigsten MATLAB-Funktionen, die zur Verarbeitung superauflösender Mikroskopie-Aufnahmen implementiert wurden. Eine vollständige Liste mit
detaillierten Funktionsbeschreibungen befinden sich im Anhang unter A.1.
Aufgabenfeld Funktion Batchfunktion
(Ebene 1/Ebene 2)
SIM Rekonstruktion PrepareSIMrecon BatchFolders
CreateResultFiles BatchFoldersToFiles oder
BatchCreateResultFiles
Korrektur CorrectSIMbleach BatchCorrectSIMbleach/
BatchFolders
CorrectSIMdrift BatchCorrectSIMdrift
BatchFolders
Visualisierung WriteResultTiffs BatchFolders
WriteResultTiffs
IndividualScale
BatchFolders
WriteImgs2Collage BatchFolders
SPDM Korrektur Fast_MFP BatchFilesInFolder/
BatchFolders
CorrectDriftOrte OrteDriftCorrection/
BatchFolders
Visualisierung Orte2SymbolMap
Analyse EvaluateFoci BatchEvaluateFoci/
BatchFolders
SIM-SPDM-
Kombination
Korrektur CorrectShiftMatchZ
Visualisierung CombineSIMspdm BatchSaveOrteSIM
3D Weitfeld Korrektur Deconvolve DeconvolveDir/
BatchFolders
Visualisierung ImgStack2Collage
WriteImgs2Collage
Allgemein Analyse PixelsAboveTH BatchMeasure
CollectIntInfo BatchMeasure
Emissionswellenlänge des Fluorophors (460 nm), dem Brechungsindex des Eindeckmediums
(1.4) und der numerischen Apertur des Objektivs (1.4) berechnet wurde. Es stehen verschiedene Entfaltungsmethoden zur Verfügung, die sich darin unterscheiden, auf welche Weise
sie Bildrauschen beim Entfaltungsprozess berücksichtigen. In Versuchsdurchgängen erwies
sich die Methode „LeastSqr“ mit 20 Iterationsschritten als optimal. Die entfalteten 3D-Bilder
wurden im Tagged Image File Format (TIFF) abgespeichert.
3.4.7. Auswertung der SIM-Aufnahmen
Zur Auswertung der SIM-Aufnahmen war zum Zeitpunkt dieser Arbeit kaum mehr als die
Rekonstruktionssoftware von Rainer Heintzmann vorhanden. Für jede Aufnahme musste der
Bildstapel in die verschiedenen Kanäle aufgeteilt als einzelne 2D TIFF Dateien gespeichert
werden, und zu jedem Kanal mussten zwei angepasste Parameterdateien erstellt werden, die
79
Kapitel 3: Methodenentwicklung
den genauen Rekonstruktionsprozess steuern. Dieser läuft in 7 Schritten ab, von denen man
3 einzeln per Kommandozeile (Windows Eingabeaufforderung) starten musste – eine sehr
mühsame und langsame Arbeitsweise. Die neu implementierten Funktionen automatisieren
den gesamten Vorgang nun so weit, dass sich die SIM-Aufnahmen eines kompletten Experiments durch die Ausführung einer einzigen Datei rekonstruieren lassen. Das Experiment
kann mehrere Präparate umfassen, zu denen es jeweils mehrere Aufnahmen mit mehreren
Kanälen gibt.
Der Ablauf der gesamten Bildverarbeitung vom Rohbildstapel bis zum rekonstruierten und
korrigierten Bild ist in Abbildung 3.13 dargestellt. Am Ende stehen zwei 3D Bilder von jedem
Kanal zur Verfügung: ein Summenbild mit konventioneller Auflösung und ein Ergebnisbild
mit verbesserter Auflösung. Das Summenbild entsteht durch bloße Kombination der PhasenSummenbilder, während das Ergebnisbild aus der vollständigen Rekonstruktion hervorgeht.
KorrekturlmechvlVer_
schiebungenlwährendl
derlSIM_Aufnahme
BatchCorrectSIMdrift
CorrectSIMdrift
BatchFolders
Bildrekonstruktion
Bildkorrektur
Darstellung
Legende“
Funktion
zugehörigelBatch_l
funktionl1EbenelH)
ggfvlBatchfunktionl
derlEbenelH_Batch_
funktionl1Ebenelü)
Arbeitsschritt
BatchCorrectSIMbleach
CorrectSIMbleach
BatchFolders
PrepareSIMrecon
batch_Processingvbat
1erstelltlvonlPrepareSIMrecon)
Processingvexe
1externelAnwendunglvonl
lRainerlHeintzmann)
Bleichkorrektur VorbereitunglderlBildrekonstruktion
Durchführunglderl
Bildrekonstruktion
BatchFolders

BatchFoldersToFiles
CreateResultFiles
Zusammenstellenl
derlErgebnisse
Driftkorrektur
BatchCorrectSIMdrift
CorrectSIMdrift
BatchFolders
BatchFolders
WriteResultTiffs
AusgabelderlBilderlalsl
TIFF_Dateien
Alternativ“lIndividuelll
skaliertelAusgabelderl
BilderlalslTIFF

Rohbildstapel
1ersteslBildlzeigtl
Kamerarauschen)
BatchFolders
WriteResultTiffs
IndividualScale
Ergebnisbildlundl
Summenbildlfürl
jedenlKanal
Fiji_Auswertungenp
Zusammenfassung
mitl„Histograph“
BatchFolders
WriteImgsüCollage
Darstellunglvonl…D_
BildernlalslüD_Collage
…D_AnsichtxüD_Pro_
jektionxVideoslmit
„Fiji“lundl„Vaa…D“
Bildauswertungen
Abbildung 3.13. | Flussdiagramm zur Auswertung von SIM-Aufnahmen. Abgebildet sind die
Schritte und MATLAB-Funktionen zur Bildkorrektur, -rekonstruktion und -darstellung.
80
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Neben der Automatisierung der Rekonstruktion wurde viel Wert auf die Bildkorrektur gelegt. Wie in Abb. 3.12c dargestellt, entsprach die pixelweise gebildete Summe der Bilder zu
allen Phasenverschiebungen des Beleuchtungsmusters an einer bestimmten Z-Position immer
einer Aufnahme mit homogener Beleuchtung. Daher standen zusammengehörige PhasenSummenbilder für jeden Rotationswinkel des Gitters zur Verfügung, die im Idealfall identisch sein müssten. Unter realen Bedingungen bleichen die Fluorophore jedoch während der
Belichtung aus, und es kann zu mechanischen Verschiebungen des Objekts (Drifts) kommen.
Beide Effekte können durch Vergleich der zusammengehörigen Phasen-Summenbilder quantifiziert und näherungsweise korrigiert werden. Zur Bleichkorrektur der SIM-Aufnahmen
wurde die Funktion CorrectSIMbleach implementiert, und zur Driftkorrektur die Funktion CorrectSIMdrift.
CorrectSIMbleach verwendet GetBleachingBtwDirs zur Bestimmung der Bleichfaktoren (relative Helligkeit) zwischen jedem Phasen-Summenbild und seiner Entsprechung
aus der nächsten Gitterrotation (für jeden Kanal getrennt). Für ihre Berechnung wird
zunächst von jedem Pixel eines Phasen-Summenbilds ein fester Korrekturwert abgezogen, der dem Kamerarauschen Rechnung trägt (evtl. entstehende negative Werte
werden auf 0 gesetzt). Nun wird die Intensitätssumme über alle Pixel gebildet. Die
Bleichfaktoren ergeben sich dann gemäß Gleichung (3.1):
B(i) =

1 | i = 1
∑P(i)
∑P(i−1)
|2≤ i≤ n
B Bleichfaktor
P Phasen-Summenbild
i Bildnummer des Phasen-Summenbilds
n Anzahl aller Phasen-Summenbilder
(3.1)
CorrectSIMbleachmittelt die Bleichfaktoren zusammengehöriger Phasen-Summenbilder und überprüft die Abweichungen zwischen den Werten aus verschiedenen ZPositionen. Sind sie konsistent (Abweichung≤10%), so werden sie gemäß Formel (3.2)
auf die einzelnen Z-Positionen umgelegt. Daraus ergeben sich die Korrekturfaktoren in
Gleichung (3.3) für jedes einzelne Phasen-Summenbild. Die Korrektur erfolgt schließlich im hintergrundbereinigten Bildstapel durch Multiplikation mit den Korrekturfaktoren gemäß Gleichung (3.4). Der Korrekturfaktor eines Phasen-Summenbilds wird auf
jedes Phasenbild angewandt, aus denen es sich zusammensetzt.
BZ =
z
B BZ Bleichfaktor zwischen 2 aufeinanderfolgende Z-Positionen
B mittlerer Bleichfaktor zwischen 2
aufeinderfolgende Gitterrotationen
z Anzahl der Z-Positionen
(3.2)
K(i) = B−iZ K Korrekturfaktor
i Index des Phasen-Summenbilds
(3.3)
Ikorr(i) = K(i) · I(i) Ikorr korrigiertes Bild
I Rohbild
(3.4)
Abbildung 3.14 veranschaulicht den Effekt der Bleichkorrektur an einer Beispielaufnahme.
81
Kapitel 3: Methodenentwicklung
100
110
120
M
itt
le re kIn
te ns itä
t A60°
60°

PhasenASummenbilderkderselbenkZA
Positionkbeikdenk3kGitterrotationen
Gi tt er ro ta tio
n vorkKorrektur nachkKorrektur
20
30
40
50
60
70
80
90
Bildnummerk(PhasenASummenbilder)
BleichkorrekturkpBRCA1AKanal
1 50 100 150
vorkKorrektur
nachkKorrektur
0° 60° A60°
Gitterrotation 2kµm
a 20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
BildnummerIGPhasenµSummenbilderZ
M
itt
le re IIn
te ns itä
t 1 44 88 132
vorIKorrektur
nachIKorrektur
0° 60° µ60°
Gitterrotation
µ60°
60°

PhasenµSummenbilderIderselbenIZµ
PositionIbeiIdenI3IGitterrotationen
Gi tt er ro ta tio
n vorIKorrektur nachIKorrekturBleichkorrektur IH2AXµKanal
2Iµm
b Abbildung 3.14. | Demonstration der Bleichkorrektur für 3D-SIM-Aufnahmen. (a) pBRCA1Kanal (647 nm Laser). (b) γH2AX-Kanal (488 nm Laser). Links: Mittlere Intensität der PhasenSummenbilder vor (blau) und nach (rot) der Korrektur mit CorrectSIMbleach. Rechts: Zugehörige
Phasen-Summenbilder an einer ausgewählten Z-Position.
82
Kapitel 3: Methodenentwicklung
CorrectSIMdrift bestimmt Driftvektoren ausgehend vom Aufnahmebildstapel und benutzt
diese zur nachträglichen Korrektur der rekonstruierten Bilder. Die Funktion verwendet
GetDriftBtwDirs zur Bestimmung linearer Driftvektoren zwischen einem PhasenSummenbild und seiner Entsprechung aus der nächsten Gitterrotation. Dabei wird
lediglich die Z-Position mit der größten Schärfe betrachtet (für jeden Kanal separat), da sich der Versatz dort am genauesten bestimmen lässt. Die schärfste Z-Ebene
wird mit FindSharpestPlane bestimmt; die Funktion basiert auf einem Bandpassfilter im Fourierraum, der Strukturinformationen von niederfrequenten diffusen Signalen und hochfrequentem Rauschen trennt. Zur sub-Pixel-genauen Bestimmung des
X-Y-Versatzes zwischen den zusammengehörigen Phasen-Summenbildern wurde der
Optimierungsalgorithmus findshift aus dem MATLAB-Paket DIPimage verwendet.
CorrectSIMdrift legt die so erhaltenen Driftvektoren auf die Verschiebungen zwischen den Z-Positionen in den rekonstruierten Bildern um, und korrigiert diese mit
Hilfe der DIPimage-Funktion shift. Die Korrektur wird in Aufnahmereihenfolge für
alle Kanäle durchgeführt, wobei der aufsummierte Versatz aller vorangehender Kanäle
immer aufgeschlagen wird, so dass die Korrektur auch über mehrere Kanäle hinweg
konsistent bleibt. „Überstände“, die aus den Verschiebungen resultieren,1 werden abgeschnitten.
In Abbildung 3.15 sind die mit GetDriftBtwDirs ermittelten Driftvektoren während einer
SIM-Aufnahme dargestellt. Die erkennbare Vorzugsrichtung des Probendrifts entlang der YAchse war typisch für alle Aufnahmen und rechtfertigte die Annahme linearer Driftgeschwindigkeitsvektoren zur Korrektur der SPDM-Aufnahmen (siehe Abschnitt 3.4.8).
Zur weiteren Auswertung der Ergebnisbilder wurde die Open Source Software Fiji [183]
benutzt, einer ImageJ-Distribution mit speziell ausgewählten Funktionspaketen für biologische Fragestellungen. Konkret wurden γH2AX- und pBRCA1-Foci mit dem Plugin 3D Object
Counter vermessen, und der Grad der Kolokalisation beider Färbungen wurde mit JACoP
(Just Another Colocalizaton Plugin) untersucht [184]. Die Erkennung und Segmentierung
der einzelnen Foci beruhte auf einem Intensitäts-Grenzwert. Außerdem wurde eine minimale
Objektgröße vorgegeben, um Einzelsignale von den eigentlichen Foci zu trennen. Ausgewertet wurden Anzahl, Volumen und Oberfläche der Foci, sowie ihre Sphärizität gemäß Formel
(3.5).
Ψ =
π
1
3 (6V )
2
3
O
Ψ Sphärizität
V Volumen
O Oberfläche
(3.5)
Die Kolokalisationsmessungen basierten auf binären Objektmasken, und enthielten somit
keine Gewichtung von Intensitätsunterschieden zwischen γH2AX- und pBRCA1-Foci. Anhand
der entfalteten DAPI-Bilder wurde das Zellkernvolumen und der mit DNA gefüllte Volumenanteil gemessen. Dazu wurde mit Hilfe des Plugins 3D Convex Hull [185] eine 3-dimensionale
konvexe Hülle um den Zellkern berechnet.
Zur 3-dimensionalen Darstellung der Bilder wurde das Plugin 3D Viewer [186] oder die
Software Vaa3D [187] verwendet. Dabei konnten die beiden Färbungen, sowie die entfalteten DAPI-Aufnahmen des Zellkerns (siehe Abschnitt 3.4.6) überlagert und aus verschiedenen
1tatsächlich entstehen keine echten Überstände, sondern herausragende Pixel werden am gegenüberliegenden
Rand in das Bild hineingeschoben und müssen dort entfernt werden.
83
Kapitel 3: Methodenentwicklung
0,213,2
26,5
39,7
52,9
66,1Gnm
0,4
0,6
0,8
1,0GPixel
30°
210°
60°
240°
90°
270°
120°
300°
150°
330°
180° 0°
x y pBRCA1GKanal
H2AXGKanal
1.GGitterrotation
2.GGitterrotation
Abbildung 3.15. | Probendrift während einer SIM-Aufnahme. Beispiel der mechanischen Verschiebungen, die während einer SIM-Aufnahme auftraten. Die Vektoren geben den Betrag und die Richtung
der Drifts zwischen den Drehungen des Beleuchtungsgitters für den γH2AX- (grün) und pBRCA1Kanal (rot) an (Drifts zwischen 1. und 2. Gitterwinkel gestrichelt, zwischen 2. und 3. durchgezogen).
Perspektiven betrachtet werden. Einzelne Ansichten wurden als 2D-Projektionen abgespeichert. Außerdem wurden einige Videos erstellt, in denen die Zellen rotierend dargestellt sind.
Für eine weitere Darstellungsform wurde in MATLAB die Funktion WriteImgs2Collage
implementiert; sie ordnet die Bilder eines 3D-Bildstapels zu einer 2D-Collage um, und ermöglicht damit auf einfache Weise die Abbildung einer Folge optischer Schnitte.
3.4.8. Auswertung der SPDM-Aufnahmen
Für die Lokalisationsdaten existierten bereits Funktionen zur Erfassung der Signalpositionen
(Rekonstruktion), für die Bildgebung und die Auswertung der Positionsinformationen unter verschiedenen Gesichtspunkten. Diese Funktionen wurden weitestgehend übernommen,
oder nur leicht modifiziert, meist um sie besser automatisieren zu können. Da sie bereits in
anderen Arbeiten beschrieben wurden, wird hier darauf verzichtet.
Zur Lokalisierung der Blinkereignisse in den Rohbildstapeln wurde die bereits vorhandene MATLAB-Funktion startSPDM verwendet (leicht modifiziert). Ein Grenzwert legt dabei
fest, wie hell ein Blinksignal gegenüber dem Bildhintergrund sein muss, damit es detektiert wird. Um überprüfen zu können, welcher Wert hier sinnvoll ist, wurde die Funktion
ShowLocEventsCL implementiert. Sie markiert die detektierten Blinkereignisse als rote
Pixel im Rohbildstapel, so dass Fehldetektionen unmittelbar ersichtlich werden. Optional
können verschiedene Signalcluster (z.B. erhalten mit der weiter unten beschriebenen Funktion EvaluateFoci) mit unterschiedlichen Farben markiert werden. Außerdem wurden
neue Filterfunktionen (FilterOrte, FilterOrteCol, OrteFromImgMask) entwickelt,
mit denen sich die lokalisierten Signale nach verschiedenen Kriterien einschränken lassen.
84
Kapitel 3: Methodenentwicklung
OrteDriftCorrection
CorrectDriftOrte
Driftkorrekturbderb
Signalpositionenbb
BatchFolders
Bildkorrektur
Darstellung
Legende:
Funktion
zugehörigebBatchRb
funktionbMEbenebHP
Batchfunktionbderb
EbenebHRBatchR
funktionbMEbeneb“P
Arbeitsschritt
Analyse
BatchFilesInFolder
Fast_MFP
Zusammenlegenbvonb
multiRframeRSignalenbb
BatchFolders
OrteDriftCorrection
CorrectDriftOrte
Driftkorrekturbderb
Signalpositionenbb
BatchFolders
AnalysebderbFociRbundb
RestsignalRVerteilung
BatchEvaluateFoci
EvaluateFoci
BatchFolders
Ergebnistabellen
zurbAuswertungbmit
„Histograph“bMExcelP
OrteRMatrizenb
getrenntbnachbFociRb
undbRestsignalen
OrteRMatrixbder
mitbstartSPDM
lokalisiertenbSignaleb
Orte“SymbolMap
EinfachebDarstellungb
AlsbTriangulationsR
bildbmitbderbSotware
„PYMEbVisualise“
Visualisierungb
Abbildung 3.16. | Flussdiagramm zur Auswertung von SPDM-Aufnahmen. Abgebildet sind die
Schritte und MATLAB-Funktionen zur Bildkorrektur, -analyse und -darstellung, ausgehend von bereits
lokalisierten Signalen in Form einer Orte-Matrix.
Nach Prüfung verschiedener Rekonstruktionsvarianten wurde der Grenzwert auf 3.0 festgelegt und kein nachträglicher Filter angewandt.
Das Ergebnis der Lokalisation ist die Orte-Matrix. Sie wird als Variable in einer MATLABDatei abgelegt, und beinhaltet Informationen zu jedem lokalisierten Signal (X- und Y-Koordinaten, die Unsicherheiten ihrer Bestimmung, zugehörige Bildnummer im Rohbildstapel...).
Mögliche Drifts während der Aufnahme verfälschen die Signalpositionen, deshalb wurden
sie mit der neuen Funktion CorrectDriftOrte korrigiert (siehe Abb. 3.16). Abbildung
3.17 zeigt den Drift während einer SPDM-Aufnahme. Anhand der Überlagerung der Korrekturbilder vor und nach der Aufnahme, ist die Verschiebung des Zellkerns und der Effekt der
Driftkorrektur erkennbar.
CorrectDriftOrte korrigiert die Signalpositionen in einer Orte-Matrix anhand eines
Driftgeschwindigkeitsvektors, der aus Korrekturbildern vor und nach der SPDM-Aufnahme ermittelt wird (hier Aufnahmen des Zellkerns im DAPI-Kanal). Mit findshift
aus dem DIPimage Paket wird der Versatz zwischen den Korrekturbildern bestimmt,
und durch den zeitlichen Versatz ihrer Aufnahme geteilt, woraus sich der Driftgeschwindigkeitsvektor ergibt. Multipliziert mit der Zeit zwischen zwei Einzelbildaufnahmen erhält man den absoluten Drift zwischen ihnen, so dass sich die Signalpositionen
in der Orte-Matrix entsprechend der Bildnummer ihrer Detektion korrigieren lassen.
Nach der Driftkorrektur wurden die Orte-Matrizen von Multi-frame-Signalen bereinigt. Dabei handelt es sich um Mehrfachdetektion der Signale eines einzelnen Blinkereignisses. Sie
kommen durch lang andauernde Fluoreszenzemissionen zu Stande, die auf mehreren Einzelbildern der SPDM-Aufnahme auftauchen, und meist Helligkeitsschwankungen zeigen. Be85
Kapitel 3: Methodenentwicklung
1 µm
a 1 µm
b Abbildung 3.17. | Driftkorrektur für Lokalisationsaufnahmen. Korrekturbilder eines Zellkerns
(DAPI-Kanal) an der selben Z-Position vor (rot) und nach (grün) einer SPDM-Aufnahme (a) vor und
(b) nach der Driftkorrektur mit der Funktion CorrectDriftOrte.
sonders bei Alexa Fluor 488, dem Fluorophor, das für die γH2AX-Färbung verwendet wurde,
können neben kurzen Lichtblitzen (<50 ms) auch häufig Fluoreszenzemissionen von mehreren 100 ms Dauer beobachtet werden. Zur Bereinigung von Multi-frame-Signalen gab es
bereits die Funktion fast_multiframepoints. Sie definiert Einträge in der Orte-Matrix
als multi-frame-Signale, wenn sie im Aufnahmebildstapel aufeinanderfolgen, und ihr Abstand kleiner ist als die Unsicherheit ihrer Positionsbestimmung. Durch Mittlung der multiframe-Signale wird eine präzisere Bestimmung der Signalpositionen erreicht. Das kombinierte Ereignis wird in die Orte-Matrix eingetragen, und die Einträge der einzelnen multi-frameSignale werden entfernt. Um fast_multiframepoints für Batchfunktionen kompatibel
zu machen, wurde sie durch die neue Funktion Fast_MFP ersetzt.
Im nächsten Schritt wurden die korrigierten Orte-Matrizen mit der neu implementierten
Funktionen EvaluateFoci und EvaluateSubFoci ausgewertet:
EvaluateFoci unterteilt die Einträge einer Orte-Matrix in Foci- und Restsignale, und analysiert ihre Signalverteilungen. Zur Unterscheidung beider Gruppen wird eine modifizierte Version der Funktion Region von Manuel Gunkel benutzt. Anschließend werden
zahlreiche Eigenschaften der einzelnen Foci, aller Foci als Gruppe, und der Restsignale berechnet. Neben der Signalanzahl und dem mittleren Abstand bis zum nächsten
Signal, wird z.B. auch die Fläche der Foci, ihre mittlere Signaldichte, ihr Schwerpunkt und der mittlere Abstand zum nächsten Fokus bestimmt. Außerdem wird ein
Lokalisationsbild erzeugt, auf dem die Foci als grüne Flächen hervorgehoben sind.
EvaluateFoci kann mit BatchEvaluateFoci erweitert werden, um alle OrteDateien eines Ordners zu bearbeiten; darüber hinaus fasst BatchEvaluateFoci die
Ergebnisse zusammen und speichert sie als Tabelle in Form einer Textdatei ab.
EvaluateSubFoci prüft, ob neben Foci kleinere Signalcluster (Subfoci) in einer OrteMatrix vorhanden sind. Die Vorgehensweise ist ähnlich wie bei EvaluateFoci. Um
sicherzustellen, dass es sich bei den Subfoci nicht um zufällige Signalcluster handelt,
werden die Ergebnisse mit einer Zufallsverteilung mit gleicher mittlerer Signaldichte verglichen. Analog zu BatchEvaluateFoci gibt es für EvaluateSubFoci die
Erweiterungsfunktion BatchEvaluateSubFoci.
86
Kapitel 3: Methodenentwicklung
Die mit BatchEvaluateFoci und BatchEvaluateSubFoci erstellten Ergebnistabellen
wurden mit dem Erweiterungsmodul für Microsoft Excel Histograph (siehe Abschnitt 3.2.3)
weiter ausgewertet und in Form von Diagrammen dargestellt. Bildliche Darstellungen der
Orte-Matrizen wurden mit der Funktion Orte2SymbolMap und der von David Baddeley
entwickelten Software PYME Visualise erzeugt. Mit Orte2SymbolMap wurden Positionsbilder erzeugt, bei denen die Signalpositionen in Form von Punkten oder anderen Symbolen
abgebildet werden, während mit PYME Visualise [163] Triangulationsbilder gerendert wurden (mit der Funktion „Jittered Triangulation“).
Die Triangulationsbilder entstehen durch Verbindung der Signalpositionen zu Dreiecken,
deren Helligkeit sich umgekehrt proportional zu ihrer Fläche verhält (je kleiner die Signalabstände, desto heller die Dreiecke). Die Signalpositionen werden mehrfach zufällig innerhalb
des Radius ihrer Lokalisationsgenauigkeit verschoben („gejittert“) und die resultierenden
Dreiecke werden überlagert.
3.4.9. Überlagerung von SIM und SPDM Bildern
Für die Kombination von 3D-SIM- und 2D-Lokalisationsbildern ist es erforderlich, die zum
Lokalisationsbild passende Z-Ebene im SIM-Bild zu finden. Theoretisch lässt sie sich zwar
aus den Z-Koordinaten des Objektivs berechnen, die bei der Aufnahme eingestellt wurden; im Allgemeinen wird diese Bestimmung jedoch aufgrund mechanischer Verschiebungen und technischer Toleranzen nur zu einer groben Näherung führen – die Umstellung
der Beleuchtungs- und Aufnahmemodi und die Aufnahmen selbst nehmen einige Zeit in
Anspruch, während der sich auch geringe Verschiebungen aufsummieren können. Berücksichtigt man zudem einen Drift zwischen den Bildern in X- und Y-Richtung, so ist das Finden der richtigen Z-Position keine triviale Aufgabe. Gelöst wurde sie mit Hilfe der Funktion
CorrectShiftMatchZ:
CorrectShiftMatchZ verwendet findshift aus den DIPimage Paket zur Versatz-Bestimmung in X- und Y-Richtung; findshift eignet sich zwar prinzipiell auch für eine
3D-Versatz-Bestimmung, jedoch nur bei gleichdimensionalen Bildern.2 Deshalb arbeitet CorrectShiftMatchZ das SIM-Bild Ebene für Ebene in Z-Richtung ab. Jede Ebene wird mit dem Lokalisationsbild so gut wie möglich zur Deckung gebracht3 und
die normierte Abweichung zwischen beiden Bildern wird gemäß Formel (3.6) berechnet. Die SIM-Ebene Eopt , die optimal zum Lokalisationsbild passt, wird nun in der
Umgebung der Ebene mit der kleinsten normierten Abweichung gesucht. Dabei wird
angenommen, dass sich die normierten Abweichungen in der Nähe von Eopt proportional zum Abstand von Eopt verhalten. Für zwei Ebenen Eo und Eu, die Eopt umgeben, entspricht das Verhältnis ihres Abstands zu Eopt dann dem Verhältnis ihrer
normierten Abweichungen. Die Z-Position von Eopt kann daher unabhängig von der
normierten Abweichung von Eopt nach (3.7) ermittelt werden. Weiterhin ergibt sich
Eopt durch lineare Interpolation von Eo und Eu gemäß (3.8). Bei idealisierten Bildern
stimmt diese Bestimmung exakt, bei realen Bildern jedoch nur näherungsweise, da
2Es ist zwar möglich das Lokalisationsbild in Z-Richtung mit schwarzen Bildern aufzustocken, um es an die Dimensionalität des SIM-Bilds anzugleichen, jedoch führt dies zu falschen Ergebnissen, da der abrupte Übergang
vom Lokalisationsbild zu den Füllbildern die Bestimmung stark beeinflusst.
3unter Verwendung von CorrectShiftEqualDims. Dabei wird der X- und Y-Versatz mit findshift bestimmt, mit shift korrigiert, und resultierende „Überstände“ werden abgeschnitten.
87
Kapitel 3: Methodenentwicklung
die normierten Abweichungen von Bildrauschen beeinflusst werden. Deshalb interpoliert CorrectShiftMatchZ Zwischenbildebenen um Eopt herum und wiederholt die
Optimierung (rekursiv) mit dem interpolierten Bildstapel, bis eine ausreichende Genauigkeit erreicht wird (Änderung der optimierten Z-Position < 1%, maximal 3 Rekursionen). Schließlich gibt CorrectShiftMatchZ das Lokalisationsbild und die am
besten dazu passende SIM-Bildebene nach der Driftkorrektur zurück, sowie den entsprechenden 2D-Versatzvektor und die übereinstimmende Z-Position im SIM-Bild.
A(i) =
1
n∗ n∗
p=1
|L∗−S∗i |
AV =
A(Eo)
A(Eu)
=
ro ru =
zopt − zo
zu− zopt
⇒ zopt =
zo ·AV + zu
AV +1
Eopt = Eo
ru ro + ru
+Eu
ro ro + tu
⇒ Eopt =
Eo +Eu ·AV
AV +1
A Normierte Abweichung
i Index der Z-Ebene im SIM-Bild
n Pixelanzahl
∗ nach Anwendung von
CorrectShiftEqualDims
p Pixelindex
L Lokalisationsbild
Si SIM-Bildebene am Z-Index i
AV Abweichungs-Verhältnis
Eo Ebene oberhalb von Eopt
Eu Ebene unterhalb von Eopt
Eopt optimal übereinstimmende Ebene
ro Abstand von Eo zu Eopt
ru Abstand von Eu zu Eopt
zo Z-Position von Eo
zu Z-Position von Eu
zopt Z-Position der optimal übereinstimmenden Ebene
(3.6)
(3.7)
(3.8)
Prinzipiell eignen sich alle auf findshift basierten Funktionen gut zur Versatz-Bestimmung
zwischen zwei Bildern, sofern diese die gleichen Strukturen abbilden; da es aber viele Möglichkeiten zur Visualisierung der Lokalisationsdaten gibt, stellte sich die Frage, welche Darstellungsform sich am besten für die Versatz-Bestimmung gegenüber dem SIM-Bild eignet.
Bei Punkt-basierten Abbildungen werden die Signalpositionen mit hellen Pixeln in das Bild
eingetragen (ggf. Gauß-förmig verschmiert entsprechend der Lokalisationsgenauigkeit), oder
in Form einfacher Symbole. Das ermöglicht zwar „Einzelmolekül-Auflösung“, gewichtet jedoch die Helligkeit von Regionen sehr geringer Signaldichte viel stärker, als dies bei den
SIM-Bildern der Fall ist (und bei allen anderen Aufnahmen, die auf dem klassischen Fluoreszenzprinzip beruhen). Im Gegensatz dazu hängt die Helligkeit bei Flächen-basierten Abbildungen, wie der Triangulationsmethode, direkt von der Signaldichte ab. Triangulationsbilder eignen sich daher besonders gut für die Versatz-Bestimmung. Der erhaltene Versatzvektor kann anschließend benutzt werden, um die Signalpositionen in der Orte-Matrix zu
korrigieren, so dass sich auch Punkt-basierte Lokalisationsbilder erstellen lassen, die sich optimal mit der gefundenen SIM-Bildebene decken. Die Funktion CombineSIMspdm benutzt
CorrectShiftMatchZ, um diese Aufgabe zu erfüllen. Außerdem erstellt sie verschiedene
Überlagerungsbilder aus der Punkt-Darstellung, dem Triangulationsbild, der rekonstruierten
SIM-Bildebene und ihrem entsprechenden Summenbild mit konventioneller Auflösung.
88
Kapitel 3: Methodenentwicklung
3.4.10. Ergebnisse aus methodischer Sicht
Abbildung 3.18 zeigt anhand einer Beispielaufnahme die Auflösungsverbesserung durch SIM
im Vergleich zu konventioneller Weitfeldmikroskopie. Die γH2AX und pBRCA1 Foci sind klar
und deutlich im SIM-Bild zu erkennen, und erscheinen deutlich schärfer als in der Weitfeldaufnahme mit konventioneller Auflösung. Vor allem die durch SIM erreichte Unterdrückung
von Streulicht außerhalb der Fokusebene verbesserte die Bildqualität erheblich und erlaubte
eine wesentlich genauere Abgrenzung zwischen verschiedenen γH2AX und pBRCA1 Foci.
H2AX
Abbildung 3.18. | Auflösungsverbesserung durch 3D-SIM. Links: Weitfeldbild mit konventioneller
Auflösung, Rechts: SIM-Bild. Die Aufnahmen zeigen γH2AX (grün) und pBRCA1 (rot) innerhalb des
Zellkerns einer U87 Zelle 30 min nach Schrägbestrahlung mit einem einzelnen 12C-Ion.
Im Vergleich zu den SIM-Bildern konnte durch SPDM eine noch stärkere Auflösungsverbesserung in 2D erreicht werden. Die durch Einzelmoleküldetektion erhaltenen Positionen der
γH2AX-gebundenen Antikörper wurden direkt als Punkte visualisiert (Abb. 3.19c,g), oder
mit Hilfe der Triangulationsmethode (Abb. 3.19d,h).
Die Überlagerung der Lokalisationsbilder mit der entsprechenden Ebene im SIM-Bild (Abb.
3.19i,j) ergab eine exzellente Übereinstimmung zwischen beiden Aufnahmen. Nur unscharfe Signale im SIM-Bild, die nicht exakt in der Fokusebene lagen, fehlten in den Triangulationsbildern, wodurch sich die bessere axiale Auflösung von SPDM bemerkbar machte.
Trotz der fundamental unterschiedlichen Fluoreszenz- und Detektionsprinzipien von SIM
und SPDM, waren dieselben Strukturen erkennbar. Verfälschungen durch Rekonstruktionsartefakte konnten somit ausgeschlossen werden.
In den SPDM Punktbildern gab es einige Signale, die weder in den Triangulationsbildern,
noch den SIM-Bildern zu sehen waren. Dabei handelte es sich um isoliert liegende Signale,
die typischerweise einen mittleren Abstand zu den nächsten 8 Nachbarsignalen von mehr als
300 nm aufwiesen. Diese Signale belegten, dass sich mit SPDM Einzelmoleküle detektieren
lassen, die durch Bildgebung, die auf dem konventionellen Fluoreszenzprinzip basiert (einschließlich SIM), nicht erfassbar sind. Bei konventioneller Fluoreszenzemission sind isolierte
89
Kapitel 3: Methodenentwicklung
a b c d
e f g h
i j Abbildung 3.19. | Auflösungsverbesserung
durch SIM und SPDM. γH2AX-Signale in einer
U87 Zelle 30 min nach Schrägbestrahlung mit
12C-Ionen. (a) Weitfeldbild mit konventioneller
Auflösung, (b) SIM-Bild, (c) SPDM Punktbild,
(d) SPDM Triangulationsbild. Der Zellkern ist
blau umrandet. (e-h) 4x Vergrößerung der gelb
eingerahmten Ausschnitte. (i) Überlagerung von
f und g. (j) Überlagerung von f und h.
Einzelsignale zu schwach um detektiert zu werden; erst bei dichter Markierung mit vielen
Fluorophoren wird eine Struktur sichtbar. Die SPDM-Visualisierung mit Hilfe der Triangulationsmethode gewichtet die Intensität einer Struktur mit der Fluorophordichte, ähnlich wie
bei gewöhnlicher Mikroskopie. Aus diesem Grund verschwinden isolierte Einzelsignale, die
keinen Beitrag zur Strukturauflösung liefern. Die Triangulationsmethode bot einen guten
Kompromiss zwischen einer „natürlichen“ Strukturwiedergabe und der erheblichen Auflösungsverbesserung aufgrund der Einzelmoleküldetektion. Folglich eignet sich diese Darstellungsform in besonderer Weise zum Vergleich von SPDM-Aufnahmen mit Bildern, die nicht
durch Lokalisationsmikroskopie erstellt wurden.
Die Ergebnisse zeigten, dass SIM und SPDM in der Lage sind, Feinstrukturen innerhalb
der γH2AX Foci aufzulösen, die mit konventioneller Mikroskopie nur unzureichend erkennbar sind. Die Kombination von SIM und SPDM erwies sich zudem als vorteilhaft, weil sie
die Stärken beider Methoden verbindet: SIM eignet sich sehr gut für 3D-Aufnahmen und
Mehrfachfärbungen mit verschiedenen Fluorophoren, und wurde deshalb zur Vermessung
der äußeren Gestalt der γH2AX- und pBRCA1 Foci ihrer Kolokalisation verwendet, während
die besonders hohe Auflösung von SPDM und die Kenntnis der Einzelmolekülpositionen eine
besonders genaue Analyse der Feinstruktur von γH2AX Foci erlaubte (siehe Abschnitt 4.3).
90
4 ERGEBNISSE
4.1. Dosis-Wirkung von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung
U87 Zellen wurden entweder am Heidelberger Ionenstrahl-Therapiezentrum (HIT) mit 12CIonen, oder an einem konventionellen Linearbeschleuniger (LinAc) zur Erzeugung von 6 MV
Photonen am DKFZ bestrahlt. Um die Dosis-Wirkung zu vergleichen wurde zunächst das
klonogene Überleben getestet (siehe Abb. 4.1). Für die 12C-Ionen-Strahlung ergab sich eine
relative biologische Wirksamkeit von 3,00 bei 50% Überleben (RBW50) und 2,64 bei 10%
Überleben (RBW10).
0,001
1
Ü
be rle
be ns fr ak tio
n 0 2 4 6 8
Dosis3(Gy)
10
0,1
0,01
RBW503=33,00
RBW103=32,64
12C-Ionen
Photonen
Abbildung 4.1. | Klonogenes Überleben. Überlebensfraktion von U87 Zellen nach Bestrahlung mit
12C-Ionen (rot) oder Photonen (blau) in Abhängigkeit von der Dosis (Fits nach linear-quadratischem
Modell). Die relative biologische Wirksamkeit der 12C-Ionen bei 50% (RBW50) und 10% (RBW10)
Überleben sind eingetragen.
Anschließend wurde untersucht, wie gut die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen
(DSBs) mit dem klonogenen Überleben korreliert und welchen Einfluss die Zellzyklusphase
dabei spielt. Hierzu wurden die Zellen mit 0,5 – 8 Gy bestrahlt und der DSB-Marker γH2AX
nach 30 min Inkubationszeit mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS) und mikroskopisch
untersucht.
4.1.1. Die relative Wirksamkeit von 12C-Ionen variiert mit der Zellzyklusphase
und der Dosis
Abbildung 4.2 zeigt die Ergebnisse der FACS-Messungen für die einzelnen Zellzyklusphasen und in der gesamten Zellpopulation. Zum Vergleich des Schadens in den verschiedenen
Zellzyklusphasen, wurde die γH2AX-Fluoreszenz auf den jeweiligen DNA-Gehalt normiert.
Sowohl in der Gesamtpopulation, als auch in den einzelnen Zellzyklusphasen wurde für beide Strahlenarten ein linearer Zusammenhang zwischen Dosis und Wirkung beobachtet, der
91
Kapitel 4: Ergebnisse
0
1z000
2z000
3z000
4z000
0 2 4 6 8
Dosisz(Gy)
G1
0 2 4 6 8
Dosisz(Gy)
S12C-Ionen
Photonen
zH 2A
Xz Fl uo re sz en z/ DN
A-
Ge ha lt 0
1t000
2t000
3t000
4t000
0 2 4 6 8
Dosist(Gy)
G2
0 2 4 6 8
Dosist(Gy)
M
tH 2A
Xt Fl uo re sz en z/ DN
A-
Ge ha lt Re la tiv
e) W
irk
un g) de r) 12
Cz Io ne n h 1)hhh
2)hhh
3)hhh
4)hhh
h 2 4 6 8
Dosis)BGyH
alle Zellen
h 1
2
3
4
5
6
G1 S G2 MalleZellen
2F
6
2F
3
5F
1
3F
6
1F
4
1F
8
1F
7
2F
4
2F
1
1F
2
1F
9
1F
9
2F
3
2F
2
1F
3
RDW1Gy
RDW4Gy
RBW1hhh
)H
2A
X)
Fl uo re sz en zN DN
Az Ge ha lt Abbildung 4.2. | Dosis-Wirkung von Photonen und 12C-Ionen: Zellzyklusspezifische γH2AXMessung (FACS). Mediane γH2AX-Fluoreszenzintensität nach Nullpunktkorrektur in U87 Zellen
30 min nach Bestrahlung mit Photonen (blau) oder 12C-Ionen (rot). Die Diagramme zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate, sowie zugehörige Regressionsgeraden. Die Werte
wurden auf den DNA-Gehalt in den einzelnen Zellzyklusphasen normiert (G1: 2N, S: 3N, G2 und M:
4N, mit N=einfacher Chromosomensatz). Unten rechts: Relative Wirkung der 12C-Ionen (RDW1 Gy,
RDW4 Gy und RBW1000), basierend auf den Regressionsgeraden.
92
Kapitel 4: Ergebnisse
10
20
30
40
50
60
70
Ze lle
n (%
)
Photonen
4 Gy 6 Gy
8 Gy
Ktr. 0,5 Gy
1 Gy 2 Gy
0
G1 S G2 M
0
10
20
30
40
50
60
70
Ze lle
n (%
)
12C-Ionen
4 Gy 6 Gy
8 Gy
Ktr. 0,5 Gy
1 Gy 2 Gy
G1 S G2 M
Abbildung 4.3. | Zellzyklusanalyse 30 min nach Bestrahlung mit Photonen oder 12C-Ionen
(FACS-Messung). Aufgetragen ist der prozentuale Anteil der einzelnen Zellzyklusphasen an der gesamten U87 Zellpopulation bei verschiedenen Strahlendosen (Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate).
sich mit Hilfe von Regressionsgeraden beschreiben ließ. Bei 12C-Ionen-Strahlung trat zwischen 0 und 0,5 Gy ein Sprung auf, der auf eine überproportional große Wirkung bei kleinen
Dosen hinwies. Gemessen an der Steigung der Regressionsgeraden reagierten die Zellen bei
gleicher Strahlenart ähnlich in der S- und G2-Phase, etwas stärker in der G1-Phase und besonders empfindlich in der M-Phase.
Insgesamt wirkten 12C-Ionen bei gleicher Dosis stärker als Photonen. Zum Vergleich wurde
anhand der Regressionsgeraden die relative dosisäquivalente Wirksamkeit (RDW) der 12CIonen bei 1 Gy (RDW1Gy) und 4 Gy (RDW4Gy) und die relative biologische Wirksamkeit bei einer normierten Fluoreszenzintensität von 1000 (RBW1000) ermittelt (siehe Säulendiagramm
in Abbildung 4.2). Generell war die relative Wirksamkeit bei 1 Gy größer als bei bei 4 Gy.
Dieses Phänomen konnte auch bei den Dosis-Wirkungs-Kurven des klonogenen Zellüberlebens (Abb. 4.1) beobachtet werden und geht auf die strahlenspezifischen Unterschiede in
der Kurvenform bei geringen Dosen (hier <0,5 Gy) zurück.
Für die gesamte Zellpopulation betrug die RDW1Gy 2,6 und die RDW4Gy 1,8. Die höchsten
Werte traten in der S-Phase auf, und hier war die RDW1Gy mehr als doppelt so groß wie die
RDW4Gy (5,1 gegenüber 2,4). In der M-Phase wirkten 12C-Ionen nur geringfügig stärker als
93
Kapitel 4: Ergebnisse
Ko nt ro lle
10 µm
0,
5
Gy 1
Gy 2
Gy 4
Gy 6
Gy 8
Gy Photonen 12C-Ionen Photonen 12C-Ionen
DAPI H2AX
Abbildung 4.4. | Beispielaufnahmen der HCS
Mikroskopie. γH2AX- Färbung (grün) und Zellkerne (blau) 30 min nach Bestrahlung mit verschiedenen Dosen Photonen oder 12C-Ionen. Die
Aufnahmen wurden mit variable Belichtungszeiten erstellt; die Auswertungen berücksichtigen
dies durch Gewichtung der Grauwerte.
Photonen gleicher Dosis und es gab den geringsten Unterschied zwischen RDW1Gy (1,4) und
RDW4Gy (1,2). Die RBW1000 stimmte gut mit der RDW4Gy überein.
Die Bestrahlung hatte nach der kurzen Inkubationszeit von 30 min keinen nennenswerten
Einfluss auf die Zellzyklusverteilung der Zellen (siehe Abb. 4.3), so dass die Ergebnisse die
Primärwirkung der Strahlung unverfälscht widerspiegeln.
4.1.2. 12C-Ionen und Photonen verursachen qualitativ unterschiedliche DSB-Foci
Um ein genaueres Bild von den Vorgängen innerhalb der Zellen nach Bestrahlung zu erhalten, wurde die γH2AX-Verteilung im Zellkern mit Hilfe der High content screening (HCS)
Mikroskopie untersucht (automatische Aufnahme und Analyse einer Vielzahl von Messparametern auf Einzelzellniveau). Abbildung 4.4 zeigt repräsentative Aufnahmen der Präparate.
Die Messergebnisse sind in Abbildung 4.5 zusammengefasst. In Übereinstimmung mit den
FACS-Ergebnissen für alle Zellen stieg die mikroskopisch ermittelte mittlere Intensität des
γH2AX-Signals linear mit der Strahlendosis an und wies für 12C-Ionen eine größere Steigung
auf als für Photonen (Abb. 4.5b). Im Gegensatz dazu verlief die Anzahl der γH2AX Foci (Abb.
4.5a) nur bis ca. 2 Gy linear, darüber entsprach der Verlauf eher einer Exponentialfunktion,
die sich einem oberen Grenzwert annähert.
Für Photonen lag der Grenzwert bei 30,5±1,0 Foci pro Zelle, für 12C-Ionen bei 22,5±1,8.
Generell wurden bei 12C-Ionen-Bestrahlung weniger Foci gemessen als bei gleicher Photonendosis. Die mittlere Fläche 12C-Ionen-induzierter Foci war jedoch im Durchschnitt 30%
94
Kapitel 4: Ergebnisse
H
a H
b c H
d H
e f
Abbildung 4.5. | Dosis-abhängige Eigenschaften der γH2AX-Färbung 30 min nach Bestrahlung
mit Photonen oder 12C-Ionen (HCS Mikroskopie). (a) γH2AX Foci pro Zellkern. (b) mittlere Intensität im Zellkern, (c) innerhalb der Foci und (d) außerhalb der Foci (pan-nukleär). (e) mittlere γH2AX
Fokusfläche. (f) Gesamtfläche der γH2AX Foci pro Zellkern. Die Diagramme zeigen Mittelwerte und
Standardabweichungen der Replikate, sowie zugehörige Regressionsgeraden (durchgezogene Linien)
bzw. exponentielle Trends der Form f (x) = ymax +We−
x s (gestrichelt). HNullpunkt-korrigierte Werte.
95
Kapitel 4: Ergebnisse
größer (Abb. 4.5e) und dadurch ergaben sich für die Gesamtflächen aller Foci pro Zellkern
(Abb. 4.5f) gleiche Werte für beide Strahlenarten.
Wie bei der Fokusanzahl zeigte sich auch bei der mittleren und gesamten Fokusfläche
eine Dosis-Wirkungs-Beziehung, die einer exponentiellen Annäherungsfunktion folgte, und
sich nur unterhalb von 2 Gy hinreichend durch eine Gerade beschreiben ließ. Der Grenzwert der mittleren Fokusfläche lag für Photonen bei 0,62±0,03µm2 und für 12C-Ionen bei
0,76±0,01µm2. Der Grenzwert für die Gesamtfläche lag in beiden Fällen bei ca. 21µm2
und betrug damit etwa 30% der durchschnittlichen Zellkernfläche.
Es stellte sich die Frage, ob die beobachteten Sättigungseffekte biologisch bedingt waren, oder ob sie messtechnische Limitationen aufzeigten, weil einzelne Foci nicht mehr voneinander unterschieden werden können, sobald ihr Abstand die optische Auflösungsgrenze
unterschreitet. Das Erreichen von Messgrenzen sollte sich durch Auffälligkeiten in der Messwertverteilung verraten. Deshalb wurden die Messwertverteilungen der Fokusanzahl und
der mittleren Fokusfläche näher betrachtet, indem die kumulative relative Häufigkeit der
Messwerte als Histogramme dargestellt wurden. Abbildung 4.6 zeigt die Ergebnisse für die
Fokusanzahl und Abbildung 4.7 für die mittlere Fokusfläche.
In beiden Fällen ergaben sich Verläufe mit ähnlicher Charakteristik: bei 6 Gy lagen ausgeprägt sigmoidale Kurven vor, während die Kurven bei 1 Gy im unteren Teil weniger stark
gekrümmt waren. Dennoch ergaben sich im Dosisvergleich bei gleicher Strahlenart sehr ähnliche Steigungen im annähernd linearen Mittelteil der Kurven. Dieses Verhalten ist typisch
für Prozesse, die der Poisson-Verteilung unterliegen und ist für die Erzeugung von DSBs
durch Strahlung zu erwarten. Verräterische Knicke und starke Änderungen der Steigung im
Mittelteil der Kurven, die stark auf das Überschreiten von Messgrenzen hindeuten, wurden
nicht gefunden. Trotz des nicht-linearen Verhaltens der Fokusanzahl und -fläche oberhalb
von 2 Gy entwickelte sich die mittlere Intensität innerhalb der Foci im gesamten Messbereich
Anzahl der H2AX Foci pro Zellkern
Abbildung 4.6. | Verteilung der γH2AX Fokusanzahl/Zellkern bei gleicher Dosis Photonen oder
12C-Ionen. Zur Darstellung der Verteilungen wurden die kumulativen relativen Häufigkeiten der
Messwerte berechnet. Die Histogramme zeigen die Mittelwerte der Replikate (durch Linien verbundene Datenpunkte), sowie die größten Abweichungen nach oben und unten (hinterlegte Flächen) für
Photonen- (Blautöne) und 12C-Ionen-Strahlung (Rottöne) bei einer Dosis von 1 Gy im Vergleich zu
6 Gy. Die Linien zwischen den Datenpunkten dienen als optische Hilfen und stellen keine Fits dar.
96
Kapitel 4: Ergebnisse
proportional zur Dosis (Abb. 4.5c), wobei die Steigung bei 12C-Ionen größer war als bei Photonen. Überraschenderweise zeigte sich in den Bereichen außerhalb der Foci (pan-nukleär)
ebenfalls eine zur Dosis proportionale Zunahme der mittleren γH2AX-Fluoreszenzintensität
(Abb. 4.5d).
Um festzustellen, ob es sich bei dem pan-nukleären γH2AX um ein biologisches Phänomen
oder nur um ein Messartefakt durch Streulicht aus den Foci handelte, wurden weitere Experimente durchgeführt. Da der dosisabhängige Anstieg des pan-nukleären Signals bei 12C-Ionen
größer war als bei Photonen, wurde bei diesen Versuchen nur mit 12C-Ionen bestrahlt. Die
Zellen wurden ausschließlich mikroskopisch untersucht und daher direkt auf Deckgläsern
bestrahlt. Dies ermöglichte die Herstellung von Proben, die sich auch für superauflösende
Mikroskopie eigneten. Die Morphologie der Zellen blieb erhalten, Beeinträchtigungen durch
das Ablösen der Zellen vom Untergrund, wie es für die FACS-Messungen erforderlich war,
konnten ausgeschlossen werden. Eine weitere Konsequenz der unterschiedlichen Präparation war, dass die Zellen ausschließlich aus der Perspektive der Bestrahlungsrichtung (von
oben) betrachtet werden konnten. Eine Verfolgung der Ionenflugbahn von der Seite war
somit nicht möglich, jedoch wurde die Beurteilung von pan-nukleärem γH2AX erleichtert.
Die Auswertung mit dem HCS Mikroskop bestätigte die vorherigen Ergebnisse, nach denen die Anzahl der γH2AX Foci und die Focifläche unterhalb von 2 Gy linear mit der Dosis
anstiegen und oberhalb davon in Sättigung gingen, obwohl sich die mittlere Intensität des
γH2AX-Signals im gesamten Zellkern über den gesamten Messbereich hinweg proportional
zur Dosis entwickelte (siehe Abb. 4.8).
Eine nähere Betrachtung der Messwertverteilungen zu der Fokusanzahl zeigte erwartungsgemäß das Verhalten einer Poisson-Verteilung, die bei kleinen Werten im Fall der unbestrahlten Kontrollen rechtsschief verlief und mit zunehmender Fokusanzahl, bzw. höherer Dosis
immer symmetrischer wurde. Abbildung 4.9 zeigt dies anhand der kumulierten relativen
Mittlere H2AX Fokusfläche (µm²)
Abbildung 4.7. | Verteilung der mittleren γH2AX Fokusfläche bei gleicher Dosis Photonen oder
12C-Ionen (HCS Mikroskopie). Zur Darstellung der Verteilungen wurden die kumulativen relativen
Häufigkeiten der Messwerte berechnet. Die Histogramme zeigen die Mittelwerte der Replikate (Datenpunkte), sowie die größten Abweichungen nach oben und unten (hinterlegte Flächen) für Photonen(Blautöne) und 12C-Ionen-Strahlung (Rottöne) bei einer Dosis von 1 Gy im Vergleich zu 6 Gy. Die
Linien zwischen den Datenpunkten dienen als optische Hilfen und stellen keine Fits dar.
97
Kapitel 4: Ergebnisse
Häufigkeiten der Fokuszahlen (Übergang von einem exponentiellen in einen sigmoidalen
Verlauf). Es ist gut erkennbar, dass die Kurven unterhalb von 2 Gy eine zur Dosis proportionale Verschiebung nach rechts (höhere Fokusanzahl) aufweisen und oberhalb von 2 Gy
kleinere bis keine Verschiebungen mehr auftreten. Die generelle Form der Kurven zeigte wieder keine Anzeichen für die Überschreitung von Messgrenzen.
H
H
ba c
Abbildung 4.8. | Dosis-abhängige Eigenschaften der γH2AX-Färbung 30 min nach Bestrahlung
mit 12C-Ionen (HCS Mikroskopie). (a) Anzahl und (b) Gesamtfläche der γH2AX Foci pro Zellkern.
(c) mittlere Intensität im Zellkern. Die Diagramme zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen der
Replikate, sowie zugehörige Regressionsgeraden (durchgezogene Linien) bzw. exponentielle Trends
(gestrichelt). HNullpunkt-korrigierte Werte.
Anzahl der H2AX Foci pro Zellkern
Abbildung 4.9. | Dosis-abhängige Verteilung der Anzahl an γH2AX Foci pro Zellkern nach 12CIonen-Bestrahlung (HCS Mikroskopie). Zur Darstellung der Verteilungen wurden die kumulativen
relativen Häufigkeiten der Messwerte berechnet. Die Histogramme zeigen die Mittelwerte der Replikate (Datenpunkte), sowie die größten Abweichungen nach oben und unten (hinterlegte Flächen).
Die Linien zwischen den Datenpunkten dienen als optische Hilfen und stellen keine Fits dar.
98
Kapitel 4: Ergebnisse
4.1.3. γH2AX kommt nicht ausschließlich in DSB-Foci vor, sondern auch
pan-nukleär
Zur weitergehenden Beurteilung von pan-nukleären γH2AX-Signalen wurde superauflösende Lokalisationsmikroskopie (SPDMPhymod) eingesetzt. Neben einer sehr hohen Auflösung in
der xy-Ebene (lateral) durch zeitlich getrennte Detektion und Lokalisation einzelner Fluorophore, ermöglichte dies die Betrachtung eines nur ∼200 nm dicken optischen Schnitts
durch die Zelle: Signale, die sich mehr als ∼100 nm oberhalb oder unterhalb der Fokalebene befanden, wurden durch den Lokalisationsalgorithmus herausgefiltert und nicht berücksichtigt. Hierdurch konnte der Beitrag von Streulicht aus den γH2AX Foci zu eventuellen
pan-nukleären Signalen stark vermindert werden (für konventionelle Weitfeldmikroskopie
beträgt die optische Schnittdicke mehr als 1µm).
Aus den Positionsinformationen der Fluorophore wurde für jedes γH2AX-Signal die mittlere Distanz zu den 4 nächstgelegenen Nachbarsignalen berechnet. Diese NN4-Distanz ist ein
Maß für die Signaldichte, bzw. die lokale γH2AX-Konzentration und nahm für geclusterte
Moleküle innerhalb der Foci besonders kleine Werte an. (siehe Abb. 4.10). Bei einer Dosis
von 1 Gy und 2 Gy traten ähnliche Verteilungen der NN4-Distanzen auf. Oberhalb von 2 Gy
zeigte sich dagegen eine Verschiebung hin zu größeren NN4-Distanzen, die auf das vermehrte Auftreten nicht geclusterter (pan-nukleärer) Signale hinwiesen.
99
Kapitel 4: Ergebnisse
Re la tiv
ez
uf ig ke itz
(P
)
30
25
20
15
10
5
0
0-9 40-49 80-89 120-129 160-169 200-209 240-249
NN4-Distanzz(nm)
6 Gy
Re la tiv
ez
uf ig ke itz
(P
)
30
25
20
15
10
5
0
0-9 40-49 80-89 120-129 160-169 200-209 240-249
NN4-Distanzz(nm)
2 Gy
Re la tiv
ez
uf ig ke itz
(P
)
30
25
20
15
10
5
0
0-9 40-49 80-89 120-129 160-169 200-209 240-249
NN4-Distanzz(nm)
4 Gy
Re la tiv
ez
uf ig ke itz
(P
)
30
25
20
15
10
5
0
0-9 40-49 80-89 120-129 160-169 200-209 240-249
NN4-Distanzz(nm)
1 Gy
1µm 1µm
konventionell SPDM
Abbildung 4.10. | NN4-Distanzen der γH2AX-Signale nach Bestrahlung mit 12C-Ionen (SPDM).
Dosis-abhängige Veränderungen in der Häufigkeitsverteilung der mittleren Distanz der γH2AX-Signale
zu ihrem nächsten 4 Nachbarn (NN4-Distanz) wiesen auf die Zunahme nicht geclusterter (pannukleärer) Signale bei Dosen über 2 Gy hin.
100
Kapitel 4: Ergebnisse
4.2. Folgen von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung im Zeitverlauf
Um die Strahlenantwort nach 12C-Ionen- und Photonenstrahlung genauer zu verfolgen, wurden Zeitreihenexperimente bei einer Dosis von 1 Gy oder 4 Gy durchgeführt. Mit Hilfe von
FACS-Messungen, HCS Mikroskopie und Western Blots wurden DSB-Reparatur, Zellzyklusblockaden und die Induktion von Apoptose oder Autophagozytose bis zu 50 h nach Bestrahlung untersucht.
4.2.1. DSBs durch Photonen werden effizienter repariert als 12C-Ionen-induzierte
Die Kinetik der DSB-Reparatur wurde anhand der γH2AX-Färbung verfolgt. Die gewählten
Messzeitpunkte erlaubten die Beobachtung der Anstiegsphase des γH2AX-Signals bis zum
Erreichen des Maximums, den Rückgang während der ersten Stunden der Reparaturphase,
sowie des verbleibenden Restschadens.
Anhand der FACS-Messungen sollte zum einen die Quantität der erzeugten DSBs beurteilt
werden und zum anderen ihre Qualität unter dem Aspekt der Reparaturgeschwindigkeit und
des Reparaturerfolgs. Als Maß für die Quantität wurden die Spitzenwerte des γH2AX-Signals
herangezogen. Der Quotient aus den Spitzenwerten nach 12C-Ionen- und Photonenstrahlung wurde verwendet um die relative dosisäquivalente Wirksamkeit der 12C-Ionen bei der
DSB-Induktion (RDWSpitze) auszudrücken. Um das Ausmaß des Reparaturaufwands zu vergleichen, wurde untersucht, wie schnell das γH2AX-Signal nach Erreichen des Spitzenwerts
wieder abnahm und wie hoch der als irreparabel anzunehmende Restschaden war. Zu diesem
Zweck wurden die relative dosisäquivalente Wirksamkeit der 12C-Ionen nach 1 h (RDW1 h),
nach 4 h (RDW4 h) und nach 50 h (RDW50 h) ausgewertet.
Abbildung 4.11 zeigt die Ergebnisse bei einer Dosis von 1 Gy. Mit Hilfe der MATLAB Curve
Fitting Toolbox wurden Fits zu den Messpunkte bis 4 h nach Bestrahlung berechnet (Details
siehe Anhang A.2). Im Allgemeinen wirkten 12C-Ionen stärker als Photonen, die Aufbauphase
der Reparaturantwort dauerte etwas länger und der Rückgang des γH2AX-Signals setzte
verzögert ein.
Übereinstimmend mit den Dosis-Wirkungs-Kurven (Abb. 4.2) ähnelten sich die Spitzenwerte bei gleicher Strahlenart in der S- und G2-Phase und lagen in der G1-Phase etwas
höher. In der M-Phase verursachte Photonenstrahlung den höchsten Spitzenwert; für 12CIonen traten große Schwankungen der Messwerte auf; tendenziell zeigte sich aber auch ein
höherer Ausschlag als in der S- und G2-Phase.
Der Rückgang des γH2AX-Signals wies zellzyklusphasen- und strahlungsspezifische Unterschiede auf: bei Photonenstrahlung konnte die DSB-Reparatur innerhalb von 4 h fast
vollständig abgeschlossen werden. Nur in G1-Zellen lag nach dieser Zeit noch ein geringer
Restschaden vor. Bei 12C-Ionen-Strahlung zeigte sich ein verzögerter Rückgang des γH2AXSignals in G1 und S im Vergleich zur G2-Phase. In jedem Fall blieb der Restschaden innerhalb
von 4 h über dem Niveau nach Photonenstrahlung.
In der M-Phase wurden, abgesehen von Messunsicherheiten, ähnliche Verläufe nach 12CIonen- und Photonenstrahlung beobachtet. Tendenziell blieb das γH2AX-Signal während der
ersten Stunden der Reparaturphase bei 12C-Ionen-Strahlung geringfügig höher als bei Photonenstrahlung; die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Auffallend war, dass nach 4 h
in beiden Fällen das Kontrollniveau deutlich unterschritten wurde. Demnach lagen in den
bestrahlten Zellen in der M-Phase weniger DSBs vor, als in den unbestrahlten. Eine mögliche
101
Kapitel 4: Ergebnisse
Zeitz(h)
G1
Zeitz(h)
S
12C-Ionen
Photonen
1 Gy
-400
-200
0
200
400
600
800
1z000
0 1 2 3 4 26 50 0 1 2 3 4 26 50
**
***
*
**
*
zH 2A
Xz Fl uo re sz en z/ DN
A-
Ge ha lt ZeitN(h)
G2
ZeitN(h)
M
-400
-200
0
200
400
600
800
1N000
0 1 2 3 4 26 50 0 1 3 42 26 50
*
NH
2A
XN
Fl uo re sz en z/ DN
A-
Ge ha lt Re la tiv
e, W
irk
un g, de r, 12
CN
Io ne n Zeit,AhX
alle Zellen 1 Gy
N400
N200
0
200
400
600
800
1,000
0 1 2 3 4 26 50
2/
3
2/
3 2/
8
2/
3
7/
2
4/
0
0
1
2
3
4
5
6
7
12
/1
26
/6
10
15
20
25
30
FF
FF
FF
RDW1h
RDW50h
RDW4h
RDWSpitze
,H
2A
X,
Fl uo re sz en z/ DN
AN
Ge ha lt 1/
0 2
/0
1/
7 2
/3
0/
5
2/
3
0/
7 1/
8
G1 S G2alleZellen
Abbildung 4.11. | Reparaturkinetik nach 1 Gy Photonen- oder 12C-Ionen-Bestrahlung: Zellzyklusspezifische γH2AX-Fluoreszenz (FACS-Messung). Mediane γH2AX-Fluoreszenzintensität nach
Nullpunktkorrektur in U87 Zellen im Zeitverlauf nach Bestrahlung mit Photonen (blau) oder 12CIonen (rot). Die Diagramme zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate, sowie
zugehörige Fits (siehe Anhang A.2). Die Werte wurden auf den DNA-Gehalt in den einzelnen Zellzyklusphasen normiert (G1: 2N, S: 3N, G2 und M: 4N, mit N=einfacher Chromosomensatz). Hochsignifikante Unterschiede sind markiert: ∗p<0,01; ∗∗p<0,005 (t-Test gemäß Abschnitt 2.6).
102
Kapitel 4: Ergebnisse
Zeit/(h)
0 1 2 3 4 26 50
-500
0
500
1/000
1/500
2/000
2/500
Zeit/(h)
0 1 2 3 4 26 50
G1 S
12C-Ionen
Photonen
4 Gy
*
***
**
**
*
*
/H
2A
X/
Fl uo re sz en z/ DN
A-
Ge ha lt ZeitG(h)
0 1 2 3 4 26 50
-500
0
500
1G000
1G500
2G000
2G500
ZeitG(h)
0 1 2 3 4
G2 M
26 50
**
*** **
GH
2A
XG
Fl uo re sz en z/ DN
A-
Ge ha lt ZeitS*hH
0 1 2 3 4 26 50
s500
0
500
1S000
1S500
2S000
2S500
alle Zellen
Re la tiv
eS W
irk
un gS de rS 12
Cs Io ne n 4 Gy
0
1
2
3
4
5
G1 S G2alleZellen
1F
6 1F
7
1F
6
1F
6
2F
9
2F
8
2F
3
2F
82F
9 3F
1
1F
0
3F
7
1F
5 1F
7
1F
4
1F
4
RDW1h
RDW50h
RDW4h
RDWSpitzeA AAA
AAA AAA
SH
2A
XS
Fl uo re sz en zN DN
As Ge ha lt Abbildung 4.12. | Reparaturkinetik nach 4 Gy Photonen- oder 12C-Ionen-Bestrahlung: Zellzyklusspezifische γH2AX-Fluoreszenz (FACS-Messung). Mediane γH2AX-Fluoreszenzintensität nach
Nullpunktkorrektur in U87 Zellen im Zeitverlauf nach Bestrahlung mit Photonen (blau) oder 12CIonen (rot). Die Diagramme zeigen Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate, sowie
zugehörige Fits (siehe Anhang A.2). Die Werte wurden auf den DNA-Gehalt in den einzelnen Zellzyklusphasen normiert (G1: 2N, S: 3N, G2 und M: 4N, mit N=einfacher Chromosomensatz). Hochsignifikante Unterschiede sind markiert: ∗p<0,005; ∗∗p<5·10 – 4; ∗∗∗p<5·10 – 5 (t-Test gemäß Abschnitt
2.6).
103
Kapitel 4: Ergebnisse
Erklärung hierfür wäre, dass der G2-Arrest erst ab einer Mindestanzahl an DSBs greift, so
dass vorgeschädigte Zellen, die unter physiologischen Bedingungen toleriert werden, aufgrund zusätzlicher Strahlenschäden nicht mehr in die M-Phase eintreten können [188].
Nach 26 h und 50 h lagen bei Bestrahlung mit Photonen (in der M-Phase auch bei 12CIonen) höhere γH2AX-Signale vor als nach 4 h. Dieser Effekt beruhte jedoch nicht auf einer erneuten Erhöhung des γH2AX-Signals in den bestrahlten Zellen, sondern kam nur zu
Stande, weil die zugehörigen Kontrollen ein niedrigeres γH2AX-Niveau aufwiesen als am
Tag der Bestrahlung; anhand der Rohdaten ohne Nullpunktkorrektur zeigte sich in keinem
Fall ein Anstieg (nicht abgebildet). Die niedrigeren Kontrollwerte lassen sich auf den Rückgang stressbedingter H2AX-Phosphorylierung während der Durchführung der Experimente
zurückführen. Die Restschädigung nach 26 h und 50 h wurde daher getrennt von der Entwicklung am Bestrahlungstag betrachtet. Insgesamt wiesen die bestrahlten Proben zu beiden Zeitpunkten einen geringfügigen Restschaden ohne signifikante Unterschiede zwischen
12C-Ionen- und Photonenstrahlung auf (mit Ausnahme der M-Phase).
Die Auswertung der relativen Wirksamkeit ergab, dass 12C-Ionen im Durchschnitt aller Zellen einen doppelt so großen DSB Primärschaden verursachten wie Photonen (vgl. RDWSpitze).
In der G1- und S-Phase lag dieser Wert etwas über dem Durchschnitt, in der G2-Phase leicht
darunter. Während der Reparaturphase ergaben sich besonders hohe RDW-Werte nach 4 h,
vor allem in der S-Phase. Die nicht signifikanten Unterschiede nach 50 h führten zu einer
relativen Wirksamkeit, die um den Wert 1 schwankte (siehe RDW50h).
Abbildung 4.12 zeigt die Ergebnisse der FACS-Messungen nach Bestrahlung mit 4 Gy. Übereinstimmend mit den den Ergebnissen bei 1 Gy, dauerte die Aufbauphase des γH2AX-Signals
bei 12C-Ionen-Strahlung länger als bei Photonenstrahlung und der Rückgang setzte verzögert ein. Bei gleicher Strahlenart ähnelte sich die Reparaturkinetik in der S- und G2-Phase,
während in der G1- und M-Phase höhere Ausschläge und andere Kurvenformen vorlagen.
In der M-Phase schwankten die Messwerte relativ stark und es gab kaum signifikante Unterschiede zwischen 12C-Ionen- und Photonenstrahlung, wobei die 12C-Ionen-Kurve tendenziell
oberhalb der Photonenkurve verlief.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei 1 Gy, erreichten 12C-Ionen bei 4 Gy eine etwas kleinere relative Wirksamkeit bei der Primärschädigung (siehe RDWSpitze). Die höhere Dosis hatte
zur Folge, dass 4 h nicht ausreichten, um die Reparatur nach Photonenbestrahlung abzuschließen. Die Reparaturkinetik ähnelte daher dem Kurvenverlauf bei 12C-Ionen-Strahlung
stärker als bei 1 Gy und es ergaben sich kleinere Werte für die relative Wirksamkeit nach 4 h
(siehe RDW4h). Nach 26 h und 50 h unterschied sich die strahlenspezifische Restschädigung
in der G1- S- und G2-Phase jedoch signifikant und es wurden höhere RDW-Werte gemessen
als am Bestrahlungstag (siehe RDW50h). Auffallend war, dass die relative Wirksamkeit der
12C-Ionen in der S-Phase bei 4 Gy kleiner blieb als in G1 und G2, entgegen der Ergebnisse
bei 1 Gy.
Neben der relativen Wirksamkeit wurden anhand der Fitkurven weitere Kenngrößen zum
genaueren Vergleich der Reparaturdynamik nach Photonen- und 12C-Ionen-Strahlung ermittelt. Es wurde angenommen, dass das γH2AX-Signal erst nach Erreichen des Spitzenwerts für
die Geschwindigkeit der DSB-Reparatur spezifisch ist, da die Reparatur in der Anstiegsphase
mit Erkennungs- und Vorbereitungsprozessen überlagert, die dem Aufbau funktionsfähiger
Reparaturkomplexe vorausgehen. Die Abklingzeit vom Spitzenwert auf die Hälfte wurde als
Halbwertszeit der Reparaturphase definiert und verwendet, um die durchschnittliche Repa104
Kapitel 4: Ergebnisse
12C-Ionen
Photonen
G1 S G2alleZellen M
Da ue r,d
er ,A
ns tie
gs ph as e: ,tM
AX
,(h
)
G1 S G2alleZellen M
4 Gy1 Gy
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0
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3
0,
7
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6
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0
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3 1
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4
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7
0,
5 0
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4
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0,5
1,0
1,5
2,0
G1 S G2alleZellen M
Ha lb w er ts ze it:
8t5
0−
tM AX
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)
G1 S G2alleZellen M
4 Gy1 Gy
0
1
2
3
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5
6
7
8
2,
5
2,
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0
0,
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1
1,
7
0,
8
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9
0,
7
3,
3 3,
4
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6
2,
5
7,
2
2,
4 2
,7
2,
1
1,
9
7,
2
G1 S G2alleZellen M
Re pa ra tu rg es ch w in di gk ei t5(
7
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15
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0
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3,
4 25
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6,
9
19
,9
19
,7
17
,0
25
,4
59
,1
44
,3
28
,7
59
,4
56
,7
71
,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
G1 S G2alleZellen M
4 Gy1 Gy
Abbildung 4.13. | Kenngrößen der DSB-Reparaturkinetik. Charakteristische Werte der DSBReparatur nach Bestrahlung mit 1 Gy (links) und 4 Gy (rechts) Photonen (blau) oder 12C-Ionen
(rot), basierend auf den Fits des durchflusszytometrisch gemessenen γH2AX-Signals (siehe Abb. 4.11,
4.12 und Anhang A.2). Oben: Dauer der Anstiegsphase (Zeit bis zum Erreichen des Spitzenwerts =
tMAX).Mitte: Halbwertszeit der Reparaturphase (gemessen ab Spitzenwert). Unten: durchschnittliche relative Reparaturgeschwindigkeit innerhalb der Halbwertszeit.
105
Kapitel 4: Ergebnisse
raturgeschwindigkeit in %/h zu berechnen. In Abbildung 4.13 sind die Ergebnisse für 1 Gy
und 4 Gy gegenübergestellt. Wie bereits qualitativ beschrieben, dauerte es bei 12C-Ionen länger, bis der Spitzenwert erreicht wurde als bei Photonen. Im Durchschnitt aller Zellen war
der Zeitunterschied bei 1 Gy (47 min) ausgeprägter als bei 4 Gy (22 min).
Die Halbwertszeiten der Reparaturphase waren bei 4 Gy länger als bei 1 Gy. Abgesehen
von der M-Phase überwog die Halbwertszeit in beiden Fällen bei 12C-Ionen- gegenüber Photonenstrahlung, wobei die Unterschiede bei 1 Gy größer waren. Entsprechend ergaben sich
für Photonen höhere Reparaturgeschwindigkeiten als für 12C-Ionen, und bei 1 Gy waren die
Werte höher und die Unterschiede zwischen Photonen und 12C-Ionen größer als bei 4 Gy.
4.2.2. Unterschiede in der Reparaturkinetik hängen wahrscheinlich mit der
Qualität der DSB-Foci zusammen
Die Ergebnisse der HCS-Mikroskopie für 1 Gy und 4 Gy sind in Abbildung 4.14 gegenübergestellt. Bei 1 Gy dauerte die Aufbauphase bis zur maximalen Ausprägung der γH2AX Foci für
beide Strahlenarten etwa 1 h. Zu diesem Zeitpunkt waren die Anzahl, die Gesamtfläche pro
Zellkern und die mittlere Fläche der γH2AX Foci maximal. Im Vergleich zwischen 12C-Ionenund Photonenstrahlung zeigte sich wie bei den Dosis-Wirkungs-Analysen (Abb. 4.5), dass
12C-Ionen weniger Foci verursachten, die aber größer waren als die Foci nach Photonenbestrahlung, so dass sich in der Summe etwa die gleiche Gesamtfläche pro Zellkern ergab.
Zwischen 1 h und 4 h nach Bestrahlung gab es kaum Veränderungen bei den Foci durch
12C-Ionen. Bei Photonenstrahlung sank die Anzahl der Foci hingegen auf das Niveau der 12CIonen-Kurve ab, die mittlere Fokusfläche schwankte um den Spitzenwert und in der Summe
unterschritt die Gesamtfläche pro Zellkern die Werte bei 12C-Ionen-Strahlung. Nach 26 h und
50 h überwog der Restschaden durch 12C-Ionen gegenüber dem durch Photonen in Bezug auf
Anzahl und Größe der Foci.
Bei 4 Gy erreichten die γH2AX Foci bereits nach 15 – 30 min ihre maximale Ausprägung;
im weiteren Verlauf zeigte sich eine ähnliche Charakteristik wie bei 1 Gy: Die Fokusanzahl
fiel bei Photonenstrahlung stärker ab als bei 12C-Ionen, die mittlere Fokusfläche stabilisierte sich nach anfänglichen Schwankungen auf ähnliche Werte wie bei 1 Gy (∼0,65µm2 bei
12C-Ionen und ∼0,45µm2 bei Photonen) und die zunächst gleich große Gesamtfläche der
Foci überwog bei 12C-Ionen ab einer Reparaturzeit von 1 h. Nach 26 h und 50 h überwog die
Anzahl und Größe der 12C-Ionen-induzierten Foci, wobei vor allem die Anzahl und Gesamtfläche zwischen beiden Zeitpunkten deutlich abnahm. Wie bei den FACS-Messungen wurde
das Kontrollniveau jedoch in keinem Fall wieder ganz erreicht.
4.2.3. Homologe Rekombination spielt bei 12C-Ionen-Strahlung eine besonders
wichtige Rolle für die DSB-Reparatur
Die DSB-Reparatur durch homologe Rekombination (HRR) wurde mit Hilfe von Western
Blots verfolgt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.15 dargestellt. Nachgewiesen wurden
phosphoryliertes BRCA1 (pBRCA1), sowie die Rekombinasen Rad51 und Rad52 (p-Rad52
= phosphorylierte Form).
pBRCA1 begünstigt HRR an Stelle von nicht-homologer End-zu-End-Verknüpfung (NHEJ)
und ist an mehreren Schritten der HRR beteiligt.
106
Kapitel 4: Ergebnisse
H
Zeits(h)
1 2 3 4 26 500
0
5
10
15
20
25
1 Gy 4 Gy
Zeits(h)
1 2 3 4 26 500
**
**
sH 2A
Xs Fo ci /Z
el lk er ns
m ²)
sG es am tf lä ch e 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Zeitm(h)
1 2 3 4 26 500
1 Gy 4 Gy
Zeitm(h)
1 2 3 40
***
*
***
***
**
**
mH 2A
Xm Fo ku sf lä ch em
m ²)
mM itt
le re 26 50
Abbildung 4.14. | Reparaturkinetik nach Photonen- oder 12C-Ionen-Bestrahlung: γH2AX Foci
(HCS Mikroskopie). Oben: Mediane Anzahl der γH2AX Foci/Zellkern ( HNullpunkt-korrigiert). Mitte:
Gesamtfläche der γH2AX Foci/Zellkern. Unten: mittlere γH2AX Fokusfläche. Die Diagramme zeigen
Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate zu den angegebenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 1 Gy (links) oder 4 Gy (rechts) Photonen (blau) oder 12C-Ionen (rot). Die Linien zwischen
den Messpunkten dienen als optische Hilfen und stellen keine Fits dar. Hochsignifikante Unterschiede
sind markiert: ∗p<0,005; ∗∗p<0,001; ∗∗∗p<1·10 – 4 (t-Test gemäß Abschnitt 2.6).
107
Kapitel 4: Ergebnisse
Abbildung 4.15. | DSB-Reparatur durch HRR (Western Blots). Auswirkung von 12C-Ionen- und
Photonenstrahlung auf die HRR-Proteine pBRCA1, Rad51 und Rad52 (p-Rad52 = phosphorylierte
Form) bei einer Dosis von 1 Gy (links) oder 4 Gy (rechts).
Bei 1 Gy bewirkten 12C-Ionen einen starken pBRCA1-Anstieg mit maximaler Ausprägung zwischen 30 min und 2 h nach Bestrahlung. Danach sank die Konzentration, blieb
jedoch auch nach 50 h noch leicht gegenüber dem Kontrollniveau erhöht. Photonen bewirkten einen verzögerten Effekt, der deutlich schwächer ausfiel als bei 12C-Ionen und
kürzer andauerte. Die pBRCA1-Konzentration erhöhte sich erst nach 2 h und lag nach
50 h wieder auf Kontrollniveau. Bei 4 Gy reagierten die Zellen langsamer auf 12C-Ionenund schneller auf Photonenstrahlung. Die pBRCA1-Konzentration blieb nach Bestrahlung mit 12C-Ionen länger erhöht, jedoch unterschied sich die Stärke der Erhöhung im
Vergleich zu Photonenstrahlung weniger deutlich als bei 1 Gy.
Rad51 vermittelt die Stranginvasion und Homologiesuche während der Synapse.
Die Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf die Proteinkonzentration von Rad51.
Rad52 stimuliert Rad51 und unterstützt die Stranginvasion und Homologiesuche.
Die Bestrahlung hatte weder Einfluss auf die Proteinkonzentration, noch die Phosphorylierung (p-Rad52) von Rad52.
Die länger anhaltende Phosphorylierung von BRCA1 durch 12C-Ionen-Strahlung deutete darauf hin, dass bei 12C-Ionen-Strahlung die HRR eine größere Bedeutung für die DSB-Reparatur hat als bei Photonenstrahlung. Bemerkenswert war, dass beide Strahlenarten gegenteilige
Effekte im Ansprechverhalten von pBRCA1 bei verschiedenen Dosen zeigten. Überraschend
108
Kapitel 4: Ergebnisse
war hierbei die besonders schnelle und starke BRCA1-Aktivierung bei 1 Gy 12C-Ionen. Da keine Veränderung der Rad51- und Rad52-Konzentration festgestellt werden konnten, ist von
einem ausreichendem Vorrat dieser Proteine auszugehen, der keine gesteigerte Expression
erforderlich machte.
4.2.4. 12C-Ionen verursachen stärkere und länger anhaltende
Zellzyklusblockaden als Photonen
Um den Einfluss der Strahlung auf die Zellzyklusprogression zu erfassen, wurde die Verteilung der Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen mit Hilfe von FACS-Messungen bestimmt.
Außerdem wurde die Zellkerngröße mit dem HCS-Mikroskop gemessen und die wichtigsten
Proteine der Zellzyklus-Regulation wurden mit Western Blots untersucht.
Abbildung 4.16 zeigt die Ergebnisse der FACS-Messungen bei 1 Gy. Innerhalb von 1 h nach
Bestrahlung erhöhte sich für beide Strahlenarten der G1-Anteil leicht zu Lasten der S-Phase.
Eine solche Verschiebung weist auf einen G1/S-Arrest hin, der bei Photonenstrahlung stärker
ausgeprägt war als bei 12C-Ionen, jedoch in beiden Fällen eher gering ausfiel. Nachfolgend
kehrte sich der Effekt um (bei Photonen bereits nach 1 h, bei 12C-Ionen erst zwischen 2 – 4 h
nach Bestrahlung). Der Anteil der M-Phase verringerte sich (bei Photonen merklich erst nach
4 h, bei 12C-Ionen bereits ab 2 h nach Bestrahlung) und der G2-Anteil erhöhte sich nach 4 h.
Diese Verschiebung wies auf das Einsetzen einer Zellzyklusblockade am G2/M-Übergang
hin. Der Effekt war bei 12C-Ionen-Strahlung stärker ausgeprägt (fast keine Mitosen mehr
nach 4 h) und hielt länger an als bei Photonenstrahlung (Vgl. Werte nach 4 h). Die für beide
Strahlenarten beobachtete Reduktion der G1-Phase nach 4 h ließ sich als unmittelbare Folge
des G2/M-Arrests erklären.
Nach 26 h und 50 h zeigte sich bei Photonenstrahlung ein gegenüber den Kontrollen erhöhter G1-Anteil und ein verringerter G2-Anteil. Im Gegensatz dazu wurde 26 h nach 12CIonen-Bestrahlung ein nur leicht erhöhter G1-Anteil und ein normales G2-Niveau gemessen;
nach 50 h lag der G1-Anteil tendenziell unter dem Kontrollniveau (nicht signifikant) und der
G2-Anteil war signifikant erhöht. Für beide Strahlenarten stimmte nach 26 h und 50 h der
M-Anteil mit dem Kontrollniveau überein und der Anteil der S-Phase lag nur geringfügig
darunter.
Bei 4 Gy gab es innerhalb der ersten Stunde nach Bestrahlung kaum Veränderungen in der
Zellzyklusverteilung und kein deutliches Indiz für einen G1/S-Arrest. Zwischen 2 und 4 h
nach Bestrahlung stieg der Anteil der Zellen in der S-Phase an. Wie bei 1 Gy fiel dieser Anstieg
bei Photonenstrahlung etwas deutlicher aus als bei 12C-Ionen; insgesamt zeigte sich eine
stärkere Erhöhung gegenüber den Kontrollen als bei 1 Gy. Im gleichen Zeitintervall fiel auf,
dass sich der G2-Anteil bei Photonenstrahlung erhöhte, bei 12C-Ionen jedoch nicht, obwohl
in beiden Fällen fast keine mitotischen Zellen mehr vorlagen.
An den Folgetagen traten die prägnantesten Veränderungen auf: für beide Strahlenarten
lag der Anteil der S-Phase deutlich unterhalb des Kontrollniveaus. Bei 12C-Ionen-Strahlung
war zudem der G1-Anteil verringert und der G2-Anteil stark erhöht. Bei Photonenstrahlung
zeigte sich im Gegensatz dazu nach 26 h ein erhöhtes G1-Niveau und der G2-Anteil war etwa
so groß wie in den Kontrollen. Nach 50 h normalisierte sich der G1-Anteil und der G2-Anteil
stieg an, blieb jedoch deutlich kleiner als bei 12C-Ionen-Strahlung.
Insgesamt sprachen die FACS-Ergebnisse dafür, dass beide Strahlenarten Zellzyklusblockaden sowohl am G1/S-, als auch am G2/M-Übergang auslösten, wobei der G1/S-Arrest
109
Kapitel 4: Ergebnisse
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n (%
)
Photonen
26 h
Ktr. 26 h
4 h
Ktr.
½ h
1 h
2 h¼ h 50 h
Ktr. 50 h
1 Gy
G1 S G2 M
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Ze lle
n (%
)
12C-Ionen
26 h
Ktr. 26 h
4 h
Ktr.
½ h
1 h
¼ h 50 h
Ktr. 50 h
2 h
G1 S G2 M
1 Gy
Abbildung 4.16. | Zellzyklusanalyse nach Bestrahlung mit 1 Gy Photonen oder 12C-Ionen (FACSMessung). Aufgetragen ist der prozentuale Anteil der einzelnen Zellzyklusphasen an der gesamten
Zellpopulation für die verschiedenen Zeitpunkte nach Bestrahlung (Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate). Die Daten wurden zeitlich gruppiert (0 – 4 h, 26 h und 50 h nach Bestrahlung);
jede Gruppe enthält eine Säule von unbestrahlten Kontrollen als Referenzwert (grau).
bei Photonenstrahlung eine größere Rolle zu spielen schien als bei 12C-Ionen-Strahlung, und
der G2/M-Arrest bei 12C-Ionen-Strahlung dominierte. Zur abschließenden Einordnung mussten jedoch weitere Daten berücksichtigt werden, da die Überwindung der Blockade in einer
bestimmten Zellzyklusphase zu temporären Effekten in den übrigen Phasen führen kann,
die leicht als weitere Blockade fehlinterpretiert werden können. An den Folgetagen nach
Bestrahlung mussten außerdem die Auswirkungen der Apoptose auf die Verteilung der Zellzyklusphasen in die Beurteilung einbezogen werden.
Da sich die Zellkerngröße mit der Zellzyklusphase ändert, wirken sich große Verschiebungen zwischen den Zellzyklusphasen auf die mittlere Zellkerngröße aus. Mit Hilfe des
HCS-Mikroskops wurde die Zellkernfläche anhand der DAPI-Färbung bestimmt. Wie in Abbildung 4.18 ersichtlich ist, reichten die relativ kleinen Verschiebungen zwischen den Zellzyklusphasen bei Bestrahlung mit 1 Gy Photonen oder 12C-Ionen nicht aus, um zu merklichen
Unterschieden gegenüber den Kontrollen zu führen. Es fiel lediglich auf, dass die Zellen am
Bestrahlungstag im Durchschnitt etwas größer waren als an den beiden Folgetagen. Damit
übereinstimmend hatten die FACS-Messungen ergeben, dass der G1-Anteil am Bestrahlungs110
Kapitel 4: Ergebnisse
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n (%
)
Photonen
26 h
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Ktr.
½ h
1 h
2 h¼ h 50 h
Ktr. 50 h
G1 S G2 M
4 Gy
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n (%
)
12C-Ionen
26 h
Ktr. 26 h
4 h
Ktr.
½ h
1 h
2 h¼ h 50 h
Ktr. 50 h
G1 S G2 M
4 Gy
Abbildung 4.17. | Zellzyklusanalyse nach Bestrahlung mit 4 Gy Photonen oder 12C-Ionen (FACSMessung). Aufgetragen ist der prozentuale Anteil der einzelnen Zellzyklusphasen an der gesamten
Zellpopulation für die verschiedenen Zeitpunkte nach Bestrahlung (Mittelwerte und Standardabweichungen der Replikate). Die Daten wurden zeitlich gruppiert (0 – 4 h, 26 h und 50 h nach Bestrahlung);
jede Gruppe enthält eine Säule von unbestrahlten Kontrollen als Referenzwert (grau).
tag niedriger war als an den Folgetagen. Dies bestätigte die Vermutung, dass die Proliferationsrate in den Kontrollen für den 26 h und 50 h Zeitpunkt trotz angepasster Einsaatdichte
bereits abnahm, womit sich vergleichsweise niedrige γH2AX-Werte erklären lassen (siehe Abschnitt 4.2.1). Die Ergebnisse für 4 Gy sind in Abbildung 4.19 zu sehen. Hier schlugen sich
die Abnahme des G1-Anteils und die gleichzeitige Zunahme des G2-Anteils 26 h und 50 h
nach Bestrahlung mit 12C-Ionen in einer deutlichen Zunahme der mittleren Zellkernfläche
nieder.
Abbildung 4.20 zeigt die Ergebnisse der Western Blots zur Zellzyklus-Regulation. Untersucht wurden die Cycline A2, B1 und E2, sowie die an Tyr15 phosphorylierte (inaktive) Form
der Cyclin-abhängigen Kinase CDK1 (p-CDK1).
Chk2 wird als Reaktion auf DSBs von ATM durch Phosphorylierung aktiviert (p-Chk2) und
löst dann Zellzyklusblockaden am G1/S oder G2/M-Übergang aus.
Bereits 30 min nach Bestrahlung stieg die p-Chk2 Konzentration stark an und blieb
bei 4 Gy unabhängig von der Strahlenart bis zu 50 h lang erhöht. Bei 1 Gy sank die
111
Kapitel 4: Ergebnisse
Ze llk
er nf lä ch e¼
m ²)
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120
12C-Ionen
Photonen
1 Gy
Ktr.
26¼h 26¼h
Ktr.
50¼h 50¼hKtr. ¼¼h ½¼h 1¼h 2¼h 4¼h
Abbildung 4.18. | Veränderungen der Zellkerngröße nach Bestrahlung mit 4 Gy Photonen oder
12C-Ionen (HCS-Mikroskopie). Die insgesamt kleinen Verschiebungen in der Zellzyklusverteilung
(siehe Abb. 4.16) reichten nicht aus, um sich anhand der mittleren Zellkernfläche bemerkbar zu machen.
Konzentration nach 4 h wieder und lag nach 26 h und 50 h bei Photonenstrahlung etwa
auf dem Kontrollniveau, bei 12C-Ionen leicht darüber.
p21 bindet an aktive CDKs und inhibiert diese, wobei vorwiegend G1/S-Blockaden ausgelöst werden.
Unabhängig von der Strahlenart stieg die p21-Expression zwischen 4 und 50 h nach
Bestrahlung an, wobei der Effekt bei 4 Gy deutlich stärker ausfiel als bei 1 Gy.
CDK1 wird durch Phosphorylierung an Thr14 und Tyr15 (p-CDK1) inaktiviert, wodurch der
Eintritt in die M-Phase verhindert wird.
Photonenstrahlung führte zu keinen nennenswerten Veränderungen gegenüber den unbestrahlten Kontrollen. 12C-Ionen verursachten bei 1 Gy eine verstärkte Phosphorylierung nach 4 h, die zu den späteren Zeitpunkten nicht mehr nachweisbar war. Bei 4 Gy
stieg der Phosphorylierungsgrad bereits nach 30 min an und blieb auch nach 26 h noch
deutlich erhöht. Erst nach 50 h war kein Unterschied mehr gegenüber den Kontrollen
erkennbar.
Cyclin A2 wird ab der S-Phase kontinuierlich stärker exprimiert und erreicht seine maximale Konzentration in der G2-Phase. Cyclin A ist sowohl für die DNA-Replikation, als
auch den Eintritt in die Mitose bis hin zur Vollendung der Prophase erforderlich.
Während 1 Gy Photonenstrahlung kaum Einfluss auf die Cyclin A2-Konzentration hatte, zeigte sich bei 1 Gy 12C-Ionen-Strahlung ein Anstieg zwischen 30 min und 4 h nach
Bestrahlung. Nach 26 h war keine Erhöhung mehr feststellbar. Bei 4 Gy Photonenstrahlung zeigte sich ein ähnliches Bild wie bei 1 Gy 12C-Ionen. Bei 4 Gy 12C-Ionen fiel die
Reaktion stärker und deutlich länger aus: die Cyclin A2-Konzentration erhöhte sich
stetig zwischen 30 min und 26 h nach Bestrahlung und lag trotz eines Rückgangs nach
50 h noch immer über dem Kontrollniveau.
112
Kapitel 4: Ergebnisse
Ze llk
er nf lä ch e5
m ²)
p<9·10¯9 p<1·10¯3
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Ktr.
265h 265h
Ktr.
505h 505hKtr. ¼5h ½5h 15h 25h 45h
12C-Ionen
Photonen
4 Gy
Abbildung 4.19. | Veränderungen der Zellkerngröße nach Bestrahlung mit 4 Gy (HCSMikroskopie). Übereinstimmend mit der Zunahme an großen G2 Zellen (siehe Abb.4.17) war die
Zellkernfläche 26 und 50 h nach 12C-Ionen-Bestrahlung signifikant erhöht (p<0,05).
Cyclin B1 akkumuliert in der G2-Phase und wird mit dem Einsetzen der M-Phase rasch
abgebaut.
Bei 1 Gy zeigten sich unabhängig von der Strahlenart ähnliche Schwankungen der Cyclin B1 Konzentration: nach 30 min war sie leicht erhöht, ging nach 2 h zurück und
erreichte nach 4 h ihr Maximum. Bei 12C-Ionen-Strahlung fiel der Einbruch nach 2 h
und die Erhöhung nach 4 h stärker aus als bei Photonenstrahlung. Bei 4 Gy zeigte sich
ein anderes Bild: Photonenstrahlung führte bis zu 4 h zu einer Erhöhung, mit einem
Maximum nach 2 h. Dem gegenüber schwankte der Cyclin B1 Gehalt bei 12C-Ionen
während der ersten 4 h nach der Bestrahlung und war nach 26 h am stärksten erhöht.
Cyclin E2 ist für den Übergang von der G1- in die S-Phase und die Initiation der DNAReplikation erforderlich und erreicht am G1/S-Kontrollpunkt die maximale Konzentration. Sobald der Eintritt in die S-Phase erfolgt, wird Cyclin E2 ubiquitiniert und
proteasomal abgebaut. Die Akkumulation von Cyclin E2 ist daher ein Marker für das
Einsetzen einer G1/S-Blockade.
1 Gy Photonenstrahlung bewirkte einen leichten Rückgang der Cyclin E2-Konzentration
nach 26 h und 50 h. Bei 12C-Ionen-Strahlung setzte bereits nach 2 h ein Rückgang ein,
der nach 26 h und 50 h stärker ausfiel als bei Photonenstrahlung. Bei 4 Gy riefen beide
Strahlenarten einen starken Einbruch von Cyclin E2 nach 26 h und 50 h hervor, der zu
dem Rückgang der S-Phase passte, welcher bei den durchflusszytometrischen Zellzyklusmessungen beobachtet wurde.
Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass 12C-Ionen-Strahlung sowohl am G1/S-, wie
auch am G2/M-Kontrollpunkt für länger andauernde Blockaden sorgte als Photonenstrahlung gleicher Dosis. Die Unterschiede traten bei 4 Gy deutlicher hervor als bei 1 Gy.
113
Kapitel 4: Ergebnisse
Abbildung 4.20. | Zellzyklus-Regulation (Western Blots). Auswirkung von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung auf die Aktivierung von Chk2 (p-Chk2) und CDK1 (p-CDK1 = inaktive Form), sowie
die Konzentration von p21 und der Cycline A2, B1 und E2 bei einer Dosis von 1 Gy (links) oder 4 Gy
(rechts).
4.2.5. 12C-Ionen lösen Apoptose effizienter aus als Photonen
Die Induktion von Apoptose wurde 26 h und 50 h nach Bestrahlung mit Hilfe von FACSMessungen anhand der Caspase-3-Aktivierung und des subG1-Peaks untersucht. Abbildung
4.21 zeigt die Ergebnisse der FACS-Messungen. Bei 1 Gy führte 12C-Ionen-Strahlung zu einem kleinen Prozentsatz Caspase-3-positiver Zellen (Casp3*+) und zu beiden Zeitpunkten
lagen ca. 1% der Zellen im subG1-Bereich. Bei Photonenstrahlung blieb sowohl der Anteil der
Caspase-3-positiven Zellen, als auch der subG1-Zellen im Durchschnitt unterhalb von 0,5%.
Vor allem gemessen an der Caspase-3-Aktivierung, ergaben sich deshalb hohe RBE-Werte.
Bei 4 Gy wurden erheblich mehr apoptotische Zellen gemessen als bei 1 Gy. Nach 26 h
war ein Drittel der 12C-Ionen-bestrahlten Zellen Caspase-3-positiv, bei Photonenstrahlung
lag der Durchschnitt bei 8,3%. Trotz des Rückgangs beider Werte am Folgetag, steigerte sich
der Anteil der subG1-Zellen nach 50 h auf 2,4% bei Photonen- und 6,2% bei 12C-IonenStrahlung. Anhand des subG1-Anteils nach 50 h stimmte die relative Wirkung der 12C-Ionen
(RDWsubG1) nach 4 Gy mit dem Wert für 1 Gy überein (2,6).
114
Kapitel 4: Ergebnisse
17
*5
7*
4
2*
7
2*
6
1
2
3
4
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Casp3*+ subG1
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1 Gy
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Casp3*+ subG1
12C4Ionen
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263h 503h 263h 503h
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0
10
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30
40
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C4
Io ne n 263h 503h
4 Gy RDWCasp3*+
RDWsubG1
0
2
4
6
8
10
4G
1
6G
2
1G
2
2G
6
Abbildung 4.21. | Apoptose nach Photonen- oder 12C-Ionen-Bestrahlung. Links: Caspase-3Aktivierung (Casp3*+) und DNA-Fragmentation (subG1) in U87 Zellen 26 h und 50 h nach Bestrahlung mit 1 Gy (oben) und 4 Gy (unten) Photonen (blau) oder 12C-Ionen (rot). Rechts: relative dosisäquivalente Wirkung der 12C-Ionen für Caspase-3-Aktivierung (RDWCasp3*+) und DNA-Fragmentation
(RDWsubG1).
Weiter wurde untersucht, in welcher Zellzyklusphase die Zellen am anfälligsten für Apoptose waren. Dazu wurde 26 h und 50 h nach Bestrahlung die Zellzyklusspezifische Verteilung
und Anhäufung der Casp3*+ Zellen ermittelt. Zur Bestimmung der Anhäufung wurde der
Quotient aus der Häufigkeit der Casp3*+ Zellen in einer bestimmten Zellzyklusphase und
dem Anteil dieser Phase an der Gesamtpopulation berechnet (Casp3*+ Index). Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.22 dargestellt. Bei 1 Gy stammten die meisten Casp3*+ Zellen aus
der G1-Phase, waren aber im Verhältnis zur Zellzyklusphasen-Verteilung nur in der G2-Phase
überrepräsentiert. Bei 12C-Ionen war die Anhäufung in der G2-Phase ausgeprägter als bei
Photonen, der absolute Anteil der G1-Phase war etwas niedriger und der G2-Anteil etwas
höher. Diese Unterschiede waren jedoch statistisch nicht eindeutig signifikant.
Bei 4 Gy befand sich der Großteil der Casp3*+ Zellen in der G2-Phase. Übereinstimmend
mit den Ergebnissen bei 1 Gy wurde in der G2-Phase eine Anhäufung der Casp3*+ Zellen
beobachtet; im Gegensatz zu 1 Gy war diese Anhäufung bei Photonen stärker ausgeprägt als
bei 12C-Ionen. Die G1-Phase war bei 4 Gy zu beiden Zeitpunkten unterrepräsentiert.
115
Kapitel 4: Ergebnisse
Ve rt ei lu ng hd er hC as p3 *+
hZ el le nh (7
)
10
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40
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0
4 Gy1 Gy
G1 S G2 M G1 S G2 M
− +
+ −
− +
+ −
+
+
+ +
+
+
− −
12C-Ionen
Photonen
26hh 50hh
Ca sp 3*
+
In de x 4 Gy1 Gy
0
1
2
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4
5
G1 S G2 M G1 S G2 M
12C-Ionen
Photonen
26 h 50 h
− +
− −


+ −
− +
+
+
+
+


Abbildung 4.22. | Zellzyklusanalyse der Casp3*+ Zellen. Oben: Zellzyklusspezifische Verteilung
und unten: Anhäufung der Casp3*+ Zellen 26 h und 50 h nach Bestrahlung mit 1 Gy (links) und 4 Gy
(rechts) Photonen (Blautöne) oder 12C-Ionen (Rottöne). Der Casp3*+ Index ist der Quotient aus der
Häufigkeit der Casp3*+ in einer bestimmten Zellzyklusphase und dem Anteil dieser Phase an der
Gesamtpopulation. + signifikant (p<0,05); – nicht signifikant (p>0,05), t-Tests gemäß Abschnitt 2.6.
Zusammenfassend waren die Zellen in der G2-Phase am anfälligsten für Apoptose, wobei
sich dosisabhängige Unterschiede im Casp3*+ Index zeigten: bei Photonenstrahlung steigerte sich die Anhäufung der Apoptose in der G2-Phase mit der Dosis.
4.2.6. Autophagozytose spielt keine Rolle für die Strahlenantwort in U87 Zellen
Mit Hilfe von Western Blots wurde untersucht, ob die Bestrahlung in U87 Zellen zu Autophagozytose führt. Abbildung 4.23 zeigt die Ergebnisse.
Beclin-1, Atg5, Atg7 und Atg12 sind an der Keimung der Isolationsmembran zur Einleitung der Autophagozytose beteiligt.
Die Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf die Konzentration dieser Proteine.
Atg3 und Atg7 vermitteln die Reifung der Isolationsmembran zum Autophagosom durch
Anhängen eines Lipids an LC3A und LC3B.
116
Kapitel 4: Ergebnisse
Auch hier konnten keine Konzentrationsänderungen festgestellt werden. Zudem zeigte
sich weder für LC3A, noch für LC3B die Bande der schneller migrierenden Lipidform.
Abbildung 4.23. | Autophagozytose (Western Blots). Auswirkung von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung auf Atg3, Atg5, Atg7, Atg12, Beclin-1, LC3A und LC3B bei einer Dosis von 1 Gy (links)
oder 4 Gy (rechts). Die Blots mit den Antikörpern gegen Atg5 bzw. Atg12 zeigen beide die Bande
des Atg5–Atg12 Heterodimers (∼55 kDa). Die Bestrahlung rief keine nennenswerten Veränderungen
hervor und die Abwesenheit einer Doppelbande bei LC3A und LC3B deutete darauf hin, dass keine
Autophagosomen gebildet wurden.
Zusammenfassend ergaben die Western Blots, dass Autophagozytose weder für Photonen-,
noch 12C-Ionen-Strahlung eine Rolle bei der Entfaltung der Strahlenwirkung spielte.
117
Kapitel 4: Ergebnisse
4.3. Struktur von DSB-Reparaturfoci nach Schrägbestrahlung mit
12C-Ionen
Zur genaueren Untersuchung der Struktur von γH2AX Foci nach 12C-Ionen-Bestrahlung
wurden an der experimentellen Ionenstrahlanlage SNAKE in Garching Schrägbestrahlungen durchgeführt. Die Ionen wurden dabei unter einem flachen Winkel (∼7°) gegenüber
der Zellebene appliziert, so dass sich die gesamte DSB-Spur des Ionendurchgangs durch den
Zellkern mikroskopisch anhand der γH2AX Foci verfolgen ließ. Es wurden Proben von mehreren Zeitpunkten bis 26 h nach Bestrahlung untersucht, um Änderungen in der Größe, Form
und Verteilung der Foci während des Reparaturprozesses nachvollziehen zu können. Neben
γH2AX wurden außerdem pBRCA1 Foci immunfluoreszent markiert und der Zellkern wurde
mit DAPI angefärbt.
Die Präparate wurden mit einem neuartigen Fluoreszenzmikroskop untersucht, das erstmals Strukturierte Beleuchtung (SIM) und Lokalisationsmikroskopie (SPDM) in einem Gerät
vereinte, so dass Aufnahmen der selben Zelle mit beiden superauflösenden Mikroskopietechniken möglich waren. Die 3-dimensionale Form der Foci und ihre Verteilung im Zellkern
wurde anhand der SIM-Aufnahmen untersucht, während die 2D Lokalisationsbilder benutzt
wurden, um die Feinstruktur und Molekülverteilung innerhalb der γH2AX Foci zu analysieren.
4.3.1. Im Zeitverlauf zeigen sich primäre und sekundäre DSB-Reparaturfoci
Abbildung 4.24 zeigt optische Schnitte durch ein typisches 3D-SIM-Bild zu jedem untersuchten Zeitpunkt; dieselben Zellen sind in Abbildung 4.24 räumlich dargestellt. Die unbestrahlten Kontrollen wiesen vereinzelte basale γH2AX- und pBRCA1-Signale auf, die im Vergleich
zu den bestrahlten Zellen in der Regel schwächer waren, und sich daher gut von den durch
die 12C-Ionen induzierten Foci unterscheiden ließen. Bereits ¼ h nach Bestrahlung waren
sowohl γH2AX, als auch pBRCA1 Foci erkennbar. Neben großen Foci, die sich entlang einer Geraden aufreihten, und den Weg des Ions durch den Zellkern preisgaben, fanden sich
kleine helle Einzelsignale im gesamten Zellkern (ausgenommen Nukleoli). Bei den Einzelsignalen handelte es sich zunächst hauptsächlich um γH2AX-Signale, im Laufe der Zeit traten
jedoch immer mehr pBRCA1-Einzelsignale auf, und nach 26 h waren fast alle Einzelsignale
pBRCA1-Signale.
Es fiel auf, dass die Foci nach 26 h grundlegend anders im Zellkern verteilt vorlagen, als zu
den vorherigen Zeitpunkten: Bis zu 4 h nach Bestrahlung waren sie entlang eines Pfads angeordnet; zwischen ¼ h und 1 h handelte es sich um gerade Pfade, nach 2 h kamen vereinzelt
leicht gekrümmte Pfade vor, und nach 4 h auch stärkere Krümmungen. Dennoch blieb die ungefähre Flugbahn des für die DSB ursächlichen Ions in jedem Fall nachvollziehbar. Nach 26 h
waren die Foci hingegen im gesamten Zellkern verteilt und ihre Anordnung bildete keinen
Pfad mehr (siehe Abb. 4.24 und 4.25).
Im Allgemeinen gab es nach Bestrahlung nur moderate zeitliche Veränderungen der mittleren Fokusgrößen, jedoch signifikante Unterschiede bei Betrachtung der größten Foci (siehe
99%-Quantile in Abb. 4.26a und 4.26b). Bis 1 h nach Bestrahlung traten zunehmend größere
γH2AX Foci auf (bis ∼1.8µm3 Volumen und ∼34µm2 Oberfläche nach 1 h), nach 2 h gab es
einen Rückgang, der bei der Oberfläche bis 4 h nach Bestrahlung anhielt, und nach 26 h kam
es zu einem erneuten Anstieg von Volumen und Oberfläche. Bei den pBRCA1 Foci war eben118
Kapitel 4: Ergebnisse
1
h h Ko nt ro lle
26
h 4
h 2
h DAPIpBRCA1 H2AX
2 µm 500 nm 2 µm 500 nm
Abbildung 4.24. | Schnittbilder von DSB-Reparaturfoci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
im Zeitverlauf (SIM). Grün: γH2AX, rot: pBRCA1, gelb: Kolokalisation von γH2AX und pBRCA1,
blau: DNA (DAPI). Die kleinen Bilder zeigen eine Schnittfolge (in Leserichtung ∆z=265 nm) an den
eingezeichneten Stellen in den großen Bildern mit 2-facher Vergrößerung (zur besseren Übersicht
ohne DAPI-Signale).
falls ein zweiphasiges Verhalten zu beobachten: hier kam es nach ½ h zum ersten Anstieg
großer Foci, der ebenfalls bis 1 h nach Bestrahlung anhielt (Maximalwerte des 99%-Quantils
∼0.6µm3 Volumen und ∼11µm2 Oberfläche), und auf den Rückgang nach 2 h folgte ein
zweiter Anstieg, bei dem das Maximalvolumen nach 26 h wieder erreicht wurde.
Als Formmaß wurde die Sphärizität der Foci ausgewertet (siehe Abb. 4.26c). Die Sphärizität beschreibt, wie kugelförmig ein Körper ist und nimmt maximal den Wert 1 an (perfekte
Kugel). In Übereinstimmung mit der länglichen Gestalt der γH2AX Foci und ihrer stark zerfurchten Struktur, wurden nach Bestrahlung deutlich kleinere Werte beobachtet, als in den
Kontrollen. Die mittlere Sphärizität lag zwischen ¼ h und 2 h bei etwa 0.4 und stieg nach 4 –
26 h wieder an. Die pBRCA1 Foci zeigten nach Bestrahlung im Mittel kleinere Veränderungen
gegenüber den Kontrollen. Die Verteilung der Sphärizität war im Gegensatz zu den γH2AX
Foci asymmetrisch, da die 1%-Quantile besonders tief lagen. Demnach gab es einige pBRCA1
Foci mit weniger sphärischer Gestalt als die des Großteils. Der Verlauf der 1%-Quantile wies
darauf hin, dass bis 1 h nach Bestrahlung zunehmend kleinere Sphärizitäten auftraten. Nach
2 h stieg das 1%-Quantil wieder und nach 4 – 26 h traten erneut weniger sphärische pBRCA1
Foci auf.
Zur Beurteilung des Reparaturvorgangs wurde die Anzahl der γH2AX und pBRCA1 Foci
pro Zelle und das aufsummierte Gesamtvolumen der Foci erhoben. Dabei wurden nur Foci
berücksichtigt, die ein größeres Volumen aufwiesen, als das entsprechende mittlere Volumen
in den Kontrollen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.27 zusammengestellt. Die Foci-Anzahl
(siehe Abb. 4.27a) zeigte ein zweiphasiges Verhalten mit einem Anstieg ab ¼ h bis 1 h nach
119
Kapitel 4: Ergebnisse
1
h DAPI
pBRCA1
h Ko nt ro lle
26
h 4
h 2
h H2AX
Abbildung 4.25. | 3D Ansichten von DSB-Reparaturfoci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen
im Zeitverlauf (SIM). Grün: γH2AX, rot: pBRCA1, gelb: Kolokalisation von γH2AX und pBRCA1,
blau: DNA (DAPI). Links: Übersichtsbilder (die Zellkerne sind angeschnitten dargestellt, um den Blick
auf die Reparaturfoci freizugeben). Rechts: Vergrößerung der mit Pfeilen gekennzeichneten Foci (ohne DAPI-Signale).
Bestrahlung, einem Abfall nach 2 h und einem erneuten Anstieg nach 4 – 26 h. Auf dem Höhepunkt des ersten Anstiegs nach 1 h wurden durchschnittlich 22.8 γH2AX und 35.2 pBRCA1
Foci gezählt. Nach 26 h lag der Durchschnitt mit 36.7 γH2AX und 64.3 pBRCA1 Foci deutlich
höher. Der Verlauf des Gesamtvolumens (siehe Abb. 4.27b) ähnelte dem der Anzahl, wobei
die durchschnittlich größeren γH2AX Foci höhere Werte erreichten.
Des Weiteren wurde der Kolokalisationsgrad von γH2AX und pBRCA1 Foci untersucht
(siehe Abb. 4.28). Dabei wurden nur Zellen berücksichtigt, die pBRCA1 Foci aufwiesen (dies
traf auf 83% aller aufgenommenen bestrahlten Zellen zu). Der Pearson Koeffizient (siehe Abb.
4.28a) ist ein Korrelationsmaß für die gegenseitige Überlappung beider Proteine [184]. Bei
vollständiger Überlagerung (identische Bilder) nimmt er den Wert 1 an1, bei vollständigem
Ausschluss –1. Hier konnten auf Grund der Größenunterschiede zwischen γH2AX und pBRCA1 Foci nur Teilüberlappungen vorkommen, weshalb der Pearson Koeffizient stets relativ
kleine Werte über Null (keine Korrelation) annahm. Dennoch zeigte sich im Zeitverlauf ein
Trend, der die rein optische Beurteilung bestätigte: Demnach folgte der Kolokalisationsgrad
einem ähnlichen zweiphasigen Verlauf, wie er bereits für das Gesamtvolumen der Foci und
weitere Parameter beschrieben wurde (vgl. Abb. 4.27).
Betrachtet man statt der volumenbezogenen Kolokalisation den mengenmäßigen Prozentsatz kolokalisierter Foci (Summe der γH2AX Foci, deren Schwerpunkt sich innerhalb eines
BRCA1 Fokus befindet und der BRCA1 Foci, deren Schwerpunkt sich innerhalb eines γH2AX
1vorausgesetzt, beide Bilder haben die selbe Intensität; hier war dies der Fall, da Binärmasken der Foci für die
Kolokalisationsmessungen verwendet wurden.
120
Kapitel 4: Ergebnisse
Ktr. Ktr.
H2
AX
F
oc i (
µm
³)
Vo lu m en d er Vo lu m en d er p BR
CA
1
Fo ci
m ³)
a Ktr. Ktr.
H2
AX
F
oc i (
µm
²)
O
be rf lä ch e de r O
be rf lä ch e de r p
BR
CA
1
Fo ci
m ²)
b Ktr. Ktr.
H2
AX
F
oc i Sp hä riz
itä
t d
er c Abbildung 4.26. | Größe und Form von γH2AX und pBRCA1 Foci nach
Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen im Zeitverlauf. (a) Volumen, (b) Oberfläche, (c) Sphärizität. Links sind die Graphen zu den pBRCA1 Foci dargestellt (rot), rechts die der γH2AX Foci (grün). Gezeigt sind die MesswertVerteilungen in Form von Box-Plots mit den nebenstehend abgebildeten Quantilen und dem arithmetischen Mittelwert. Mit + gekennzeichnete Verteilungspaare unterschieden sich signifikant voneinander, mit - gekennzeichnete nicht
(Kolmogorov-Smirnov Test auf Gleichheit zum Signifikanzniveau von 0,05).
121
Kapitel 4: Ergebnisse
pBRCA1
H2AX
p<0,03
Ktr.
An za hl kd er kF oc i/Z
el lk er n 17,5
pBRCA1
H2AX
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
p<0,004
p<0,002
Ktr.
Ge sa m tv ol um en Fd er FF
oc iF(
µm
³)
Abbildung 4.27. | Eigenschaften der γH2AX und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit 12CIonen im Zeitverlauf. (a) Anzahl, (b) Gesamtvolumen und (c) Gesamtoberfläche. Berücksichtigt
wurden alle Foci eines Zellkerns mit einem größeren Volumen als dem mittleren Volumen in den
unbestrahlten Kontrollen. Die Säulen zeigen die Mittelwerte aller Aufnahmen, die Fehlerbalken ihre
Standardabweichungen. Nach 26 h waren die Mittelwerte signifikant gegenüber dem Maximum der
primären Reparaturantwort 1 h nach Bestrahlung erhöht (t-Tests gemäß Abschnitt 2.6).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
p<0,05
Abbildung 4.28. | Kolokalisation von γH2AX- und pBRCA1 Foci nach Schrägbestrahlung mit
12C-Ionen im Zeitverlauf (SIM). (a), Pearson Korrelationskoeffizient, (b) prozentualer Anteil kolokalisierter Foci. Die Säulen zeigen die Mittelwerte aller Aufnahmen, die Fehlerbalken ihre Standardabweichungen. Nach 26 h war der prozentuale Anteil der kolokalisierten Foci signifikant gegenüber
dem Maximum der primären Reparaturantwort nach 1 h erhöht (t-Tests gemäß Abschnitt 2.6).
Fokus befindet, geteilt durch die Anzahl aller Foci), so ergibt sich ein etwas anderes Bild (siehe Abb. 4.28b): Bis 4 h nach Bestrahlung schwankten die Werte nur geringfügig um einen
Durchschnitt von ∼21%, während nach 26 h ein signifikant höherer Kolokalisationsgrad gemessen wurde (∼35%).
Insgesamt wiesen die Daten auf eine primäre und eine sekundäre Strahlenantwort hin.
Primär entwickelten sich DSB-Reparaturfoci entlang der Ionenflugbahn durch den Zellkern,
die nach 1 h ihre volle Ausprägung erreichten, und sich nach 2 h wieder zurückbildeten.
122
Kapitel 4: Ergebnisse
0
200
400
600
800
1h 000
1h 200
1h 400
Vo lu m en h(µ
m ³)
1 600
-4p<7·10
-5p<2·10Zellkern
DNA
¼ h ½ h 1 h 2 h 4 h 26 hKtr.
Abbildung 4.29. | Zellkern- und DNA-Volumen nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen. Zur Berechnung des DNA-Volumens wurden die entfalteten DAPI-Aufnahmen unter Verwendung eines Intensitätsschwellwerts in eine 3-dimensionale Maske mit DAPI-positivem Volumen konvertiert. Das
Zellkernvolumen wurde aus der konvexen Hülle um diese Maske berechnet. Die Säulen zeigen die
Mittelwerte aller Aufnahmen, die Fehlerbalken ihre Standardabweichungen. Nach 26 h gab es signifikante Erhöhungen gegenüber den Werten nach 1 h (t-Tests gemäß Abschnitt 2.6).
Im Vergleich zu den pBRCA1 Foci bauten sich die γH2AX Foci schneller auf (Anstieg des
Volumens nach ¼ h gegenüber ½ h), erreichten im Durchschnitt das 3- bis 4-fache Volumen
und wiesen eine geringere Sphärizität auf, was sich sowohl auf die länglichere Gestalt, als
auch die zerklüftetere Struktur der γH2AX Foci zurückführen ließ. Bei der Anzahl überwogen
die pBRCA1 Foci ½ h nach Bestrahlung um 54%.
Nach 4 h begann die sekundäre Strahlenantwort mit einer leichten Zunahme der Anzahl
und Größe der γH2AX und pBRCA1 Foci. Nach 26 h wiesen die Zellen schließlich etwa 1.6
mal mehr γH2AX Foci und 1.8 mal mehr pBRCA1 Foci auf als auf dem Höhepunkt der primären Strahlenantwort nach 1 h. Bezogen auf das Gesamtvolumen pro Zelle ergab sich für
beide Fociarten eine Verdopplung. Außerdem fielen 26 h nach Bestrahlung Unterschiede in
der Verteilung, der Form und der Struktur der Foci gegenüber den früheren Zeitpunkten auf,
und der Grad der Kolokalisation zwischen γH2AX und pBRCA1 Foci war besonders hoch.
BRCA1 hat neben seiner Funktion als DSB-Reparaturenzym auch regulatorische Bedeutung für die Einleitung von Zellzyklusblockaden am G2/M-Übergang. Interessanterweise
zeigte sich bei der Auswertung der DAPI-Aufnahmen ein signifikant erhöhtes Zellkernvolumen und des DNA-Volumens nach 26 h, der auf einen G2/M-Arrest schließen ließ (siehe
Abb. 4.29). Umgekehrt waren beide Werte bis ½ h nach Bestrahlung niedriger als in den
unbestrahlten Kontrollen und wiesen auf eine mögliche Blockade am G1/S-Übergang hin.
4.3.2. Foci Substruktur
Um einen detaillierteren Einblick in die innere Struktur der γH2AX Foci zu erlangen, wurden
optische Schnitte der 3D-SIM Aufnahmen und die durch SPDM erhaltenen Lokalisationsdaten ausgewertet (siehe Abb. 4.30). Die optischen Schnitte zeigten, dass die Foci im Inneren
nicht homogen aufgebaut waren, sondern aus mehreren Subfoci bestanden. In den SIMBildern stellten sich diese Subfoci als gewundene längliche Strukturen dar, die teilweise wie
Ketten von dicht aneinandergereihten runden Objekten aussahen. Durch die Überlagerung
123
Kapitel 4: Ergebnisse
h Ct r 2
h 4
h 1
h 26
h Fokus
Subfoci
Abbildung 4.30. | Innere Struktur der γH2AX Foci. SPDM Triangulationsbilder (weiß) wurden mit
der entsprechenden Ebene im 3D-SIM-Bild (rot) überlagert. Neben den gesamten Zellkernen (blau
umrandet) sind 4x vergrößerte Ansichten der gelb eingerahmten Regionen abgebildet. Die höhere laterale Auflösung der SPDM-Bilder enthüllte einige Strukturdetails, die mit SIM nicht aufgelöst werden
konnten.
mit den SPDM-Bildern konnten viele Abschnitte dieser Ketten noch feiner aufgelöst werden
und es erhärtete sich der Eindruck, dass die γH2AX Foci aus Ketten von mehr oder weniger
runden Subfoci aufgebaut sind.
Die Zusammensetzung der Foci aus vielen einzelnen Subfoci erklärt die zerfurchte Oberfläche der Primärfoci in den 3D-SIM-Bildern. Die nach 26 h vorhandenen Sekundärfoci bestanden ebenfalls aus mehreren Subfoci, die den primären glichen, jedoch durch ihre kreisrunde
Anordnung zu einer glatteren Focioberfläche führten. Zur quantitativen Charakterisierung
der Subfoci wurden Clusteranalysen anhand der SPDM Positionsinformationen durchgeführt.
Zur Definition der Subfoci wurde ein Schwellwert gesetzt, der die minimale lokale Signaldichte vorgibt. Um Artefakte zu vermeiden, wurden die Daten mit Zufallsverteilungen von
Signalen mit gleicher mittlerer Dichte verglichen. Der Schwellwert wurde so gewählt, dass
die Wahrscheinlichkeit von Zufallsclustern unter 0,5% betrug. Eine Analyse der Signaldistanzen zeigte eindeutige Unterschiede zwischen den Originaldaten und den Zufallsverteilungen
(siehe Abb. A.1 im Anhang unter A.3). Die Vorgehensweise lieferte eine gute Übereinstimmung der Cluster (im Folgenden Subfoci genannt) mit den offensichtlichen Strukturen in
den SIM- und SPDM-Triangulationsbildern (siehe Abb. 4.31a). Wie in den SIM-Bildern, traten auch außerhalb der Ionenspur, bzw. außerhalb der Foci, vereinzelte kleine Subfoci auf.
Um diese von den Subfoci innerhalb der Foci zu unterscheiden, wurden die Foci-Regionen
basierend auf den SIM-Bildern markiert. Abbildung 4.31b zeigt die unterschiedliche Dichte
124
Kapitel 4: Ergebnisse
ba Abbildung 4.31. | SPDM-basierte Clusteranalyse der γH2AX-Signale. (a) SPDM-Bild einer U87
Zelle 30 min nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen. Links: gesamter Zellkernen (blau umrandet anhand DAPI Bild). Rechts: 2,5x vergrößerte Ansicht der gelb eingerahmten Region. Die Signale wurden
in Subfoci (blau), Foci (Subfoci-Cluster, rot) und Restsignale (Graustufen) eingeteilt. (b) Mittlere Distanzen zu den nächsten 4 Nachbarsignalen (NN4-Distanzen) in Subfoci, Foci und Restsignalen.
der Signale in den Foci, den Subfoci und dem restlichen Zellkern anhand der mittleren Distanz zu den nächsten 4 Nachbarn (NN4-Distanz). Die Subfoci wiesen zu allen Zeitpunkten
eine konstante mittlere NN4-Distanz von 32,6 ± 2,1 nm auf. In den Foci-Regionen betrug
die NN4-Distanz durchschnittlich 56,5 ± 5,3 nm und die restlichen Signale wiesen NN4Distanzen größer 100 nm auf (in den unbestrahlten Kontrollen sogar ∼250 nm).
Nachfolgend wurde untersucht, wie sich die Eigenschaften der Subfoci innerhalb und außerhalb der Foci im Zeitverlauf verhielten. Die Anzahl der Subfoci pro Zellkern (siehe Abb.
4.32a) veränderte sich zeitabhängig und zeigte ein ähnliches biphasisches Verhalten wie bereits für die Focianzahl beschrieben. Nach 1 h Reparaturzeit erreichte die durchschnittliche
Subfocianzahl ihren ersten Spitzenwert (93 innerhalb und 114 außerhalb der Foci). Auf den
anschließenden Abfall folgte ein erneuter Anstieg der Subfocianzahl nach 26 h. Bei genauerer Betrachtung zeigte sich, dass dieser Anstieg auf Subfoci innerhalb der Foci beschränkt
war. Dies stimmte mit der Beobachtung überein, dass nach 26 h vergleichsweise wenige kleine Einzelsignale außerhalb der Foci in den 3D-SIM-Aufnahmen vorhanden waren. Die hohe
Varianz in der Messung der Subfocianzahl hängt vermutlich mit der Auswahl der optischen
Schnittebene zusammen, die bei SPDM besonders dünn ist.
Zur Abschätzung der Subfocigröße wurde ein flächenäquivalenter Kreisdurchmesser berechnet2 (siehe Abb. 4.32b). Der Durchmesser der Subfoci war innerhalb der Foci (113,3
± 9,4 nm) größer als außerhalb (90,1 ± 5,2 nm) und veränderte sich kaum während der
Reparaturzeit. Mit der mittleren Signalanzahl der Subfoci (Abb. 4.32c) verhielt es sich ähnlich (8,3 ± 0,7 innerhalb und 6,3 ± 0,3 außerhalb der Foci). Aufgrund der unbekannten
Markierungs- und Detektionseffizienz ist diese Angabe nur ein relatives Maß für die Anzahl der γH2AX-Moleküle pro Subfokus. Als Formmaß der Subfoci wurde ihre Zirkularität
berechnet3. Die Zirkularität ist eine Maß für die Ähnlichkeit einer Fläche mit einem Kreis.
2der flächenäquivalente Kreisdurchmesser berechnet sich gemäß

4 ·Fläche/π .
3die Zirkularität wurde gemäß 4π(Fläche/Umfang2) berechnet. Aufgrund der Pixelgeometrie können Kreise in
digitalen Bildern nur angenähert werden und besitzen eine kleinere Zirkularität als 1. Dies wurde berücksichtigt, indem die Zirkularität der Subfoci auf die eines Kreises mit flächenäquivalentem Durchmesser normiert
wurde.
125
Kapitel 4: Ergebnisse
c b d a Abbildung 4.32. | Eigenschaften der γH2AX Subfoci nach Schrägbestrahlung mit 12C-Ionen im
Zeitverlauf (SPDM). (a) Anzahl der Subfoci pro Zellkern, (b) Signalanzahl pro Subfokus, (c) flächenäquivalenter Kreisdurchmesser, (d) Zirkularität. Von jedem Zellkern wurde der Median des jeweiligen
Parameters berechnet. Die Diagramme zeigen die Mittelwerte und Standardabweichungen davon für
die Subfoci innerhalb der Foci und im restlichen Zellkern.
Ein perfekter Kreis hat den Wert 1, abweichende Formen ergeben kleinere Werte. Aufgrund
der länglicheren Gestalt der Subfoci innerhalb der Foci-Regionen, wiesen diese eine kleinere
Zirkularität auf als die Subfoci im restlichen Zellkern (siehe Abb. 4.32d). Im Zeitverlauf zeigte sich, dass die Zirkularität innerhalb der Foci tendenziell immer weiter absank (von 0,83
in den Kontrollen 0,69 nach 26 h), während die Subfoci im restlichen Zellkern annähernd
kreisrund blieben. Wegen der länglichen Gestalt der Subfoci in den Foci darf der äquivalente
Kreisdurchmesser nicht mit der Dicke der Struktur verwechselt werden. Anhand von Stichproben wurde die Dicke einiger besonders länglicher Subfoci auf ca. 40 – 60 nm abgeschätzt
(nicht abgebildet).
Die pBRCA1 Foci, die nur im SIM-Modus aufgenommen wurden, wiesen ebenfalls Subfoci
auf, die jedoch schwerer voneinander zu unterscheiden waren. Verglichen mit den γH2AX
Subfoci war ihre Anzahl geringer und sie schienen größer zu sein; hierbei ist jedoch zu
bedenken, dass die Auflösung bei der pBRCA1-Detektion entsprechend der längeren Emissionswellenlänge des verwendeten Fluorophors (629 gegenüber 528 nm) geringer war.
126
5 DISKUSSION
Bei der Strahlenbehandlung von Tumoren bietet die Strahlentherapie mit 12C-Ionen gegenüber der konventionellen Therapie mit Photonen physikalische und biologische Vorteile.
Schwerionen ermöglichen eine bessere physikalische Dosiskonformation der Tumoren und
haben bei gleicher Dosis eine erhöhte biologische Wirksamkeit. Am Anfang dieser Arbeit
stand die Frage nach dem Grund für die erhöhte relative biologische Wirksamkeit (RBW)
von 12C-Ionen-Strahlung. Die RBW für den Endpunkt „Reduktion des klonogenen Überlebens“ lag beispielsweise bei U87 Glioblastomzellen im klinisch relevanten Dosisbereich von
1 – 3 Gy zwischen 2 und 3. Bei gleicher physikalischer Strahlendosis tragen Photonen und
12C-Ionen gleich viel Energie in die Zelle ein, so dass gleich viele Ionisierungen möglich
sind, die zu DNA-Schäden führen. Die Art dieser Schäden und ihre Wirkungen können sich
jedoch erheblich unterscheiden.
Maßgeblich für das Überleben der Zelle sind DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), da sie die
schwerwiegendsten Strahlenschäden darstellen. Die Untersuchungen der DSBs in U87 Zellen anhand des DSB-Markers γH2AX deuteten darauf hin, dass nicht die bloße Anzahl der
DSBs, sondern ihre dichte Clusterung mit der erhöhten Wirksamkeit der 12C-Ionen-Strahlung
assoziiert ist. Zudem zeigte sich, dass die Wirkung der 12C-Ionen weniger stark von der Zellzyklusphase abhängt als bei Photonenstrahlung. Dies ist wahrscheinlich ebenfalls auf stärker
geclusterte DSBs bei 12C-Ionen-Strahlung zurückzuführen, da deren Reparatur in größerem
Maße von der homologen Rekombination abhängig ist.
Um die Erscheinung der DSB-Reparaturfoci auf DNA-Ebene visualisieren und quantifizieren zu können, sind optische Methoden der superauflösenden Mikroskopie im Kontext der
Schwerionenbiologie zum Einsatz gekommen, die aufgrund ihrer wesentlich höheren Auflösung eine neue Perspektive bei der Untersuchung chromosomaler Strukturen bieten. Hierbei
zeigte sich insbesondere, dass 12C-Ionen-induzierte γH2AX Foci aus vielen kleineren Subfoci
bestehen. Diese Subfoci wiesen eine Ausdehnung in der Größenordnung von 100 nm auf und
hatten teilweise eine längliche Gestalt, die vermutlich durch die lokale Chromatinstruktur an
den DSB Schadensstellen vorgegeben wurde. Nach dem Abklingen der Primärfoci konnte eine zweite Welle von DSB-Reparaturfoci beobachtet werden. Die Sekundärfoci unterschieden
sich in mehreren Aspekten von den Primären und wiesen auf eine replikationsbedingte Entstehung hin.
5.1. DSBs, γH2AX und relative Wirksamkeit
Zur Untersuchung der Effekte von 12C-Ionen-Strahlung im Vergleich zu Photonenstrahlung
wurden U87 Glioblastomzellen am Heidelberger Ionentherapiezentrum mit 1,2 – 2,4 GeV
12C-Ionen oder am Deutschen Krebsforschungszentrum mit 6 MV Photonen bestrahlt. Zunächst wurden Dosis-Wirkungs-Versuche zur RBW-Bestimmung der 12C-Ionen durchgeführt.
Hinsichtlich der Reduktion des klonogenen Überlebens zeigten die Ionen eine 2,6 – 3,0-fach
127
Kapitel 5: Diskussion
stärkere Wirkung als Photonen bei gleicher physikalischer Dosis (in Gy=J·kg–1) und Überlebensraten zwischen 50 und 10%.
Um die Ursachen für die unterschiedliche Wirksamkeit zu beleuchten, wurde die Induktion
von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) durch Immunfluoreszenz-Nachweis von γH2AX untersucht. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS) wurde die Induktion des DSB-Markers
30 min nach Bestrahlung in den verschiedenen Zellzyklusphasen gemessen. Die Messungen
ergaben lineare Dosis-Wirkungs-Beziehungen zwischen 0,5 und 8 Gy und wiesen auf eine
überproportional große Wirkung der 12C-Ionen unterhalb von 0,5 Gy hin. Gegenüber Photonenstrahlung war die relative dosisäquivalente Wirkung der 12C-Ionen (Wirkungsverhältnis 12C-Ionen/Photonen bei gleicher Dosis) bei 1 Gy (RDW1Gy) daher größer als bei 4 Gy
(RDW4Gy). In der gesamten Zellpopulation betrug die RDW1Gy 2,6 und die RDW4Gy 1,8.
Im Vergleich zwischen den Zellzyklusphasen reagierten die Zellen in der M-Phase am sensibelsten auf die Bestrahlung (größte Steigung der Regressionsgeraden) und der Einfluss
der Strahlenart war am geringsten (RDW-Werte nahe 1). Gegenüber der M-Phase war die
Strahlenempfindlichkeit in den übrigen Zellzyklusphasen geringer. Bei 12C-Ionen-Strahlung
unterschied sie sich nur geringfügig zwischen G1, S- und G2-Phase, während bei Photonenstrahlung größere Unterschiede auftraten, die zu unterschiedlich hohen RDW-Werten führten. In der S-Phase war die relative Wirksamkeit der 12C-Ionen am größten und die Zellen
zeigten die geringste Sensitivität gegenüber Photonenstrahlung, gefolgt von der G2- und der
G1-Phase. Die Ergebnisse zeigten, dass die Strahlenwirkung bei 12C-Ionen weniger stark von
der Zellzyklusphase abhängt, als bei Photonen.
Um zu verstehen, wieso die Wirkung der 12C-Ionen weniger von der Zellzyklusphase abhängt, stellte sich zunächst die Frage, warum Photonenstrahlung in den verschiedenen Phasen unterschiedlich stark wirkt. Die Unterschiede in der γH2AX-Induktion lassen mindestens zwei Interpretationen zu: entweder die Anfälligkeit der DNA für DSBs unterscheidet
sich Zellzyklus-abhängig, oder die Zellen reagieren in den einzelnen Phasen unterschiedlich
stark/schnell auf die DSBs. Die relativ geringe Sensitivität von S-Phase-Zellen gegenüber
Photonenstrahlung wird häufig darauf zurückgeführt, dass die DNA-Reparatur besonders aktiv ist und die offene Chromatinstruktur während der Replikation eine schnelle und effektive
Schadensbehebung fördert [189,190]. Zellzyklus-abhängige Unterschiede im Chromatinstatus nehmen vermutlich sowohl auf die Bruchwahrscheinlichkeit, als auch die Kinetik der
Strahlenantwort Einfluss [191–193].
Eine höhere Packungsdichte der DNA erhöht theoretisch die Effizienz der Bruchinduktion,
da dies die Trefferquote erhöht [194]. Im Gegensatz dazu schützt ein höherer Proteingehalt
im Chromatin die DNA wie eine Abschirmung. Untersuchungen auf der Basis der PulsfeldGelelektrophorese belegen, dass ionisierende Strahlung mehr Strangbrüche erzeugt, wenn
die Chromatinproteine entfernt werden [195,196]. Basierend auf der Zahl der γH2AX Foci legen weitere Studien nahe, dass die DSB-Anfälligkeit im Heterochromatin aufgrund des
höheren Proteinanteils geringer ist als im Euchromatin [197]. Diese Interpretation setzt allerdings voraus, dass sich die γH2AX Foci in Hetero- und Euchromatin mit gleicher Effizienz
bilden und detektieren lassen. Aufgrund der verminderten Zugänglichkeit des Heterochromatins erscheint dies fraglich, denn dies erschwert sowohl die H2AX-Phosphorylierung in
vivo, als auch die Bindung des γH2AX-Antikörpers in vitro. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass DSBs im Heterochromatin durch lokale Chromatinumlagerungen zum Euchromatin
hin verschoben werden, bevor sie effizient repariert werden [198–201].
128
Kapitel 5: Diskussion
Bei der mikroskopischen Auszählung der γH2AX Foci zeigte sich ein Sättigungseffekt bei
Dosen oberhalb von 2 Gy, obwohl die γH2AX-Konzentration (Fluoreszenzintensität) wie bei
den FACS-Auswertungen weiterhin linear mit der Dosis anstieg. Die Sättigung trat unabhängig von der Strahlenart auf, wobei die maximale Focianzahl bei Photonen größer war als bei
12C-Ionen. Auch unterhalb der Sättigungsdosis verursachten Photonen mehr Foci als 12CIonen. Dies ist ein typisches Ergebnis, das in der Literatur bereits für verschiedene Zelllinien
beschrieben wurde [202]. Glaubt man der These dass 1 γH2AX Fokus genau einem DSB
entspricht [63], hieße dies, dass 12C-Ionen weniger DSBs verursachen als Photonen gleicher
Dosis. Tatsächlich vertritt eine Studie zur Wirkung von 12C-Ionen-Strahlung in Fibroblasten
diese Annahme [203], wobei der Premature Chromosome Condensation Assay [204] zur
Quantifizierung von Chromosomenbrüchen verwendet wurde. Die erhöhte RBW der 12CIonen wird hierbei einer unterschiedlichen Qualität der Schäden zugeschrieben: die Komplexität und Reparaturanforderung der 12C-Ionen-Schäden soll größer sein als bei Photonen.
Die Autoren sind der Ansicht, dass dies auf eine stärkere Clusterung der DSB-Schäden zurückzuführen sei.
Neben reinen DSB-Clustern können auch geclusterte Nicht-DSB-Schäden und Mischformen von DSBs und anderen Schäden die DNA-Reparatur erschweren [20,23,24,205]. Zuweilen werden komplexe DSBs in der Literatur als eigenständige Schadenform betrachtet
und getrennt von einfachen DSBs behandelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird die
Frage der DSB-Anzahl getrennt von ihrem verteilungsbedingten Komplexitätsgrad betrachtet. Frühe Experimente zur Wirkung von Schwerionenbestrahlung, die auf der PulsfeldGelelektrophorese oder dem Comet-Assay [206] basierten, ergaben einen höheren Anteil
kleiner DNA-Fragmente im Vergleich zu Photonenstrahlung, ein Indiz, das für multiple DSBs
in räumlicher Nähe spricht [196]. Allerdings erforderten diese Methoden sehr hohe Strahlendosen und sind nicht in der Lage, DSBs von Einzelstrangbrüchen zu unterscheiden.
γH2AX Foci sind recht große Strukturen, die sich über mehrere Mbp im Chromatin erstrecken [44]. Entsprechend können sie keine DSBs auflösen, die innerhalb dieser Größenordnung beieinander liegen [207] Hinzu kommt, dass die Anzahl der γH2AX Foci durch
den Vorrat an H2AX Molekülen und deren Verteilung innerhalb des Chromatins begrenzt
wird. Verschiedene Zelllinien weisen mitunter einen sehr unterschiedlichen H2AX-Gehalt
auf, der in Säugerzellen zwischen 2 und 25% pro H2A-Histon (entsprechend 1 – 12,5% pro
Nukleosom) schwankt [39]. Es gibt also eine biologisch bedingte Obergrenze für die Anzahl
der γH2AX Foci. Zusätzlich muss die messtechnische Limitation beim Zählen der Foci berücksichtigt werden: liegt der Abstand zweier Foci unterhalb der optischen Auflösung des
Mikroskops, so können sie nicht getrennt erfasst werden [200,208].
Im vorliegenden Fall wies die Häufigkeitsverteilung der Focianzahl nicht auf die Überschreitung einer Messgrenze bei Dosen >2 Gy hin. Außerdem änderte sich die Größe der
Foci (mittlere Fokusfläche) oberhalb von 2 Gy nicht wesentlich. Es ist daher nicht davon auszugehen, dass der Sättigungseffekt der Focianzahl ausschließlich auf Unterscheidungsprobleme von räumlich überlagerten Foci zurückzuführen ist. Eine Erschöpfung des H2AX-Vorrats
ist hingegen auszuschließen, da für beide Strahlenarten keine Sättigung bei der γH2AXIntensität vorlag, und außerdem im Mittel nur 30% der Zellkernfläche von γH2AX Foci eingenommen wurde. Eine mögliche Erklärung für die Sättigung der Focianzahl und -größe
trotz linear mit der Dosis steigender Intensität wäre, dass die Bruchanfälligkeit der DNA in
der Nähe eines DSBs steigt. Bei höheren Dosen würden dann bevorzugt komplexe DSBs ent129
Kapitel 5: Diskussion
stehen, die zwar die Intensität der Foci erhöhen, jedoch keine neuen erzeugen, wie es bei
isolierten DSBs der Fall wäre.
Bemerkenswert ist, dass 12C-Ionen im Vergleich zu Photonen zwar weniger, dafür aber
größere γH2AX Foci hervorbrachten, so dass sich bei gleicher Dosis in der Summe gleich
große Gesamtflächen der Foci pro Zellkern ergaben. Dies könnte bedeuten, dass 12C-Ionen
vergleichbar viele DSBs induzieren wie Photonen, die jedoch dichter geclustert sind. In diesem Fall ließe sich die stärkere biologische Wirkung der 12C-Ionen allein auf die Schadenskomplexität zurückführen. Laut [202] besteht ein Zusammenhang zwischen dem LET, der
Bruchkomplexität und der Größe der γH2AX Foci. Aufgrund der hier gemessenen höheren γH2AX-Intensität durch 12C-Ionen bestehen jedoch Zweifel an der Gleichheit der DSBAnzahl im Vergleich zur Photonenbestrahlung; die DSB-Anzahl könnte bei 12C-Ionen zusätzlich zur Dichte der Schäden erhöht sein und einen Teil der biologischen Wirkung ausmachen.
Ältere Messungen der DSB-Anzahl mit Hilfe der Pulsfeld-Gelelektrophorese weisen ebenfalls
darauf hin, dass sowohl die Clusterdichte, als auch die Gesamtanzahl an DSBs mit zunehmendem LET ansteigen [209].
Neben der direkten Induktion geclusterter DSBs könnte auch eine schnelle Relokation von
DSBs über Distanzen von 1 – 2 µm in „Reparaturzentren“ zur Entstehung großer γH2AX
Foci und dem Sättigungseffekt in der Focianzahl beitragen [210,211]. Die Existenz solcher
Reparaturzentren ist jedoch umstritten [212]. Die Hypothese der Reparaturzentren stützt
sich primär auf die Beobachtung, dass entlang der Flugbahn einzelner Schwerionen große
Lücken zwischen den DSB-Reparaturfoci liegen, obwohl aufgrund des hohen LETs auch dort
DSBs entstehen müssten [213]. Mikroskopische Untersuchungen zur Beweglichkeit von DSBReparaturfoci sprechen gegen eine generelle Verschiebung von DSBs [214]. Tatsächlich zeigen die meisten Foci eine hohe Ortsstabilität mit subdiffusivem Charakter [215]. Auf heterochromatische DSBs scheint dies jedoch nicht zuzutreffen. Stattdessen mehren sich die
Hinweise darauf, dass heterochromatische DSBs gezielt an die Grenze zum Euchromatin umgelagert werden [199,200,202]. Obwohl dies nicht zwingend eine gezielte „Sammlung“ der
DSBs im Sinne der Reparaturzentren bedeutet, könnte es dennoch die zufällige Vereinigung
mehrerer Reparaturfoci fördern.
Unabhängig von der Frage, warum heterochromatische DSBs verlagert werden, liegen
Verschiebungen von 1 – 2 µm in der Größenordnung und Beweglichkeit ganzer Chromosomenterritorien [216,217]. Bei solch weiträumigen Verlagerungen der DSBs besteht die
Gefahr, dass zusammengehörige Bruchenden verloren gehen und Translokationen zur Folge
haben [218]. Auch dieser Aspekt ist bei geclusterten DSBs sicherlich von größerer Relevanz,
als im Fall von isolierten DSBs, und könnte zur biologischen Wirksamkeit der 12C-IonenStrahlung beitragen.
Bei der Auswertung der Dosis-Wirkungs-Experimente wurde neben den diskreten γH2AX
Foci ein diffuses, pan-nukleäres γH2AX-Signal entdeckt, dessen mittlere Intensität im Vergleich zu den Foci etwa halb so groß war. Wie bei den Foci stieg die mittlere Intensität
des pan-nukleären Signals linear mit der Strahlendosis und lag bei 12C-Ionen höher als bei
Photonen. Aufgrund der Korrelation mit der Dosis und der Abwesenheit des Phänomens in
unbestrahlten Zellen, konnte es sich nicht um ein Artefakt durch unspezifische Antikörperbindung handeln. Ein weiterer Versuch mit superauflösender Lokalisationsmikroskopie ergab
außerdem keinen Hinweis darauf, dass die pan-nukleäre Fluoreszenz lediglich Streulicht aus
den Foci darstellte. Das pan-nukleäre γH2AX war in fast allen Zellen vorhanden und un130
Kapitel 5: Diskussion
terschied sich von der deutlich helleren Färbung, die nach UV-Bestrahlung in der S-Phase
beobachtet wird [219]. Stattdessen handelte es sich vermutlich um die pan-nukleäre H2AXPhosphorylierung, die 2013 von Meyer et al. [220] beschrieben wurde: Im Unterschied zu
der Situation nach UV-Bestrahlung wird diese Form von pan-nukleärem γH2AX von ionisierender Strahlung verursacht und kommt in allen Zellzyklusphasen vor. Die Phosphorylierung ist Chromatin-gebunden, kolokalisiert mit MDC1, jedoch nicht mit 53BP1, und löst
keine weitergehende Schadensantwort aus. Übereinstimmend mit den vorliegenden Daten
ist das pan-nukleäre γH2AX-Signal dosisabhängig, aber weder mit Apoptose, noch mit DSBs
außerhalb der Foci assoziiert [220].
Meyer und Kollegen konnten zeigen, dass die pan-nukleäre H2AX-Phosphorylierung von
ATM und DNA-PK vermittelt wird. Da DNA-PK nur während der Bindung an DSBs aktiv ist,
wird vermutet, dass sich die Kinase zusammen mit kleinen DNA-Fragmenten durch komplexe DSBs im Nukleoplasma verteilt [220]. Damit übereinstimmend bewirkt die Transfektion mit kurzen dsDNA-Fragmenten eine Hyperaktivierung von DNA-PK, die ebenfalls zu
pan-nukleärem γH2AX führt [221]. Übertragen auf die vorliegenden Daten wäre die höhere pan-nukleäre γH2AX-Intensität nach 12C-Ionen-Strahlung demnach ein Indiz für stärker
geclusterte DSBs gegenüber Photonenstrahlung. ATM ist allerdings nicht auf permanente
Assoziation mit der DNA angewiesen, um aktiv zu bleiben und könnte die pan-nukleäre
H2AX-Phosphorylierung auch unabhängig von DNA-Fragmenten vermitteln [220].
5.2. DSB-Reparatur und Schadenskomplexität
Um einen Einblick in das Reparaturverhalten und die Spätfolgen der Bestrahlung zu erhalten, wurden Zeitreihenexperimente durchgeführt. Der Rückgang des γH2AX-Signals wurde
durchflusszytometrisch gemessen, um die Reparaturgeschwindigkeit abzuschätzen. Als charakteristische Größe wurde die relative Abnahme der Fluoreszenz innerhalb der Halbwertszeit (zwischen Spitzenwert und halbmaximalem Wert) bestimmt. Diese Angabe unterschätzt
die tatsächliche Reparaturgeschwindigkeit im Sinne der Versiegelung von DSB-Enden pro
Zeiteinheit, da die Dephosphorylierung von H2AX nach der Reparatur verzögert eintritt. Der
Vergleich zwischen den FACS- und HCS-Ergebnissen zeigt, dass sich die γH2AX-Focianzahl
pro Zelle schneller verringert als die Gesamtintensität. Daraus lässt sich schließen, dass die
Dephosphorylierung nicht unmittelbar nach der Reparatur erfolgt, sondern erst nach Umlagerung der γH2AX-Moleküle. Es gibt Hinweise, dass γH2AX zunächst durch ein unphosphoryliertes H2AX Molekül ausgetauscht wird, und die Dephosphorylierung erst erfolgt, nachdem das freigesetzte γH2AX-Molekül an eine anderen Stelle im Chromatin diffundiert, wo es
von der Phosphatase PP4 erkannt wird [222]. Für den Vergleich der Reparaturkinetik nach
Photonen- und 12C-Ionen-Bestrahlung sollte die Unterschätzung der absoluten Reparaturgeschwindigkeit unerheblich sein [223].
Die Ergebnisse zeigten, dass Photonen-induzierte DSBs effizienter repariert werden als
12C-Ionen-induzierte. Die Reparatur setzte bei 12C-Ionen verzögert ein (längere γH2AXAnstiegsphase) und dauerte länger an. Die Reparaturgeschwindigkeit (relativ zur Höhe des
Schadens) war bei 12C-Ionen-Strahlung geringer und weniger stark von der Dosis und der
Zellzyklusphase abhängig, als bei Photonenstrahlung. Für beide Strahlenarten ergaben sich
bei 1 Gy höhere Reparaturgeschwindigkeiten als bei 4 Gy; bei Photonenstrahlung waren diese Unterschiede jedoch erheblich größer als bei 12C-Ionen-Strahlung. Insbesondere in der S131
Kapitel 5: Diskussion
und G2-Phase zeigten sich für Photonenstrahlung Hinweise auf mehr als doppelt so große
Reparaturgeschwindigkeiten bei 1 Gy im Vergleich zu 4 Gy; bei 12C-Ionen-Strahlung lagen
die Abweichungen unterhalb von 25%.
Die dosisspezifischen Unterschiede bei der Reparatureffizienz nach Bestrahlung mit Photonen deutet auf eine unterschiedliche Gewichtung bei der Wahl des DSB-Reparaturwegs hin.
Hierfür spricht, dass die Reparaturgeschwindigkeit bei 4 Gy auch in der G1-Phase niedriger
war, in der die Reparatur fast ausschließlich auf nicht-homologer End-zu-End-Verknüpfung
beruht, da keine homologe Rekombination möglich ist. Die nicht-homologe End-zu-EndVerknüpfung läuft schneller ab als die Reparatur durch homologe Rekombination und setzt
in der Regel vorrangig ein [93]. Die vergleichsweise hohen Reparaturgeschwindigkeiten bei
1 Gy lassen eine stärkere Beteiligung der nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfung als bei
4 Gy vermuten. Die Ursache hierfür könnte eine zunehmende Erschöpfung der Reparaturkapazität durch nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung sein.
Bei 12C-Ionen-Strahlung hatte die Dosis nur wenig Einfluss auf die Reparaturgeschwindigkeit (außer in der M-Phase). Die im Vergleich zu 1 Gy Photonenstrahlung viel kleineren
Reparaturgeschwindigkeiten in der S- und G2-Phase deuten auf eine stärkere Beteiligung der
homologen Rekombination bei 12C-Ionen hin (siehe [205,224]). Die Western Blot-Analysen
des für die homologe Rekombination essenziellen Proteins pBRCA1 bestätigten dies. Die
Wahl des DSB-Reparaturwegs in der späten S- und G2-Phase hängt wahrscheinlich sowohl
von der Komplexität der Chromatinstruktur [225], als auch des Schadens [24] ab. Welcher
Faktor der entscheidende ist, konnte bisher nicht geklärt werden.
Goodarzi und Kollegen publizierten 2010, dass heterochromatische DSBs außerhalb der
G1-Phase generell durch homologe Rekombination repariert werden, unabhängig von der
Schadenskomplexität [225]. Übertragen auf die hier vorliegenden Ergebnisse hieße dies,
dass 12C-Ionen-Strahlung einen höheren Anteil der Schäden im Heterochromatin hinterlassen müsste als Photonenstrahlung. Außerdem müsste angenommen werden, dass sich bei
Photonenstrahlung das Verhältnis zwischen eu- und heterochromatischen DSBs abhängig
von der Dosis ändert, da die Reparaturgeschwindigkeit bei 1 Gy deutlich höher war als bei
4 Gy. Da bei höherer Dosis lediglich die Photonendichte, nicht jedoch die Photonenenergie
ansteigt, ändert sich aber nichts an den grundlegenden Wechselwirkungen. Deshalb erscheint
ein solches Szenario im untersuchten Dosisbereich wenig plausibel.
Die Eigenschaften der γH2AX Foci sprechen vielmehr für einen Zusammenhang zwischen
der Schadenskomplexität und der Wahl des Reparaturwegs. Trotz höherem Gesamtschaden bei 12C-Ionen-Strahlung (RDWSpitze ca. 2 bei 1 Gy und 1,5 bei 4 Gy) traten weniger
Foci als bei Photonenstrahlung auf, die jedoch größer waren und länger bestehen blieben. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass 12C-Ionen- im Gegensatz zu Photonenstrahlung komplexere DSBs erzeugt, deren Reparatur schwieriger ist und stärker von
der homologen Rekombination abhängt. Einige andere Arbeiten kommen zu dem gleichen
Schluss [226–230]. Unabhängig davon ist anzunehmen, dass nicht-homologe End-zu-EndVerknüpfung generell zuerst angewandt wird; misslingt die Reparatur in der S- oder G2Phase, so kann stattdessen homologe Rekombination eingeleitet werden [95,229]. Dass komplexe DSBs zumindest teilweise durch nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung repariert
werden können, zeigt sich an einer verminderten Reparaturkapazität bei Unterdrückung
dieses Reparaturwegs [231]. Schwerionenstrahlung scheint jedoch speziell die klassische
DNA-PK-abhängige Form der nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfung zu hemmen [232].
132
Kapitel 5: Diskussion
5.3. Irreparable DSBs und ihre Spätfolgen
Dass 12C-Ionen-induzierte DSBs aufgrund ihrer Clusterung schwerer zu reparieren sind als
Photonen-induzierte, zeigte sich nicht nur an der Reparaturgeschwindigkeit, sondern auch
anhand des Restschadens, der persistierenden Zellzyklusblockaden und der Apoptoseinduktion. Bei 1 Gy überwog die Anzahl der nach 50 h verbleibenden γH2AX Foci bei 12C-IonenStrahlung etwa um das Doppelte und bei 4 Gy um das 3-fache (übereinstimmend mit den
FACS-Ergebnissen bei 4 Gy: RDW50h = 2,9). Gleichzeitig führten 12C-Ionen bei beiden Dosen
zu 2,6x so viel abgeschlossener Apoptose (subG1-Messung) und 6,2 – 7,4x so vielen Zellen
mit eingeleiteter Apoptose (Casp3*+).
Bei Betrachtung der Zellzyklusverteilung zeigte sich vor allem bei 4 Gy, dass 12C-IonenStrahlung stärkere und länger anhaltende Zellzyklusblockaden verursachte als Photonenstrahlung. Beide Strahlenarten lösten sowohl G1/S-, als auch G2/M-Blockaden aus, jedoch
dominierte bei 12C-Ionen der G2/M-Arrest, während bei Photonen tendenziell der G1/SArrest überwog. Dies deckte sich mit der Zellzyklus-spezifischen Verteilung der Casp3*+
Zellen und betonte die besondere Relevanz der homologen Rekombination für die Reparatur 12C-Ionen-induzierter DSBs. Obwohl bei 12C-Ionen-Strahlung mehr Casp3*+ Zellen
aus der G2-Phase stammten als bei Photonenstrahlung, lag der Casp3*+ Index bei 4 Gy für
Photonenstrahlung 1,6 – 2,2x höher. Demnach führen G2-Blockaden bei Photonenstrahlung
effizienter zur Einleitung der Apoptose als bei 12C-Ionen-Strahlung. Dies widerspricht nicht
den übrigen Ergebnissen, da 12C-Ionen aufgrund des viel stärkeren G2-Blocks in der Summe
mehr apoptotische G2-Zellen erzeugte; dennoch überrascht dieses Resultat, zumal bei 1 Gy
12C-Ionen den höheren Casp3*+ Index in der G2-Phase aufwiesen (nicht signifikant).
Dies beruhte allein auf dosisspezifische Unterschieden im Casp3*+ Index bei Photonenstrahlung: die Werte stiegen von 1 Gy zu 4 Gy um mehr als das Doppelte, während sie bei
12C-Ionen-Strahlung ungefähr gleich blieben (∼2). Dies könnte bedeuten, dass die Dosis
(nur) bei Photonenstrahlung einen Einfluss auf die Effizienz der Apoptoseinduktion in G2Zellen hatte. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass überlebende Zellen, die sich nach Überwindung einer Zellzyklusblockade weiter teilen, den Casp3*+ Index verfälscht haben. Prinzipiell konkurriert die Apoptoseinduktion mit anderen Spätfolgen der Bestrahlung, wie Seneszenz, Autophagozytose oder dem Zelltod durch mitotische Katastrophe. Dosis-abhängige
Unterschiede in der Apoptose-Effizienz können deshalb ein Indiz für Verschiebungen dieser
Verhältnisse sein.
Autophagozytose konnte nicht nachgewiesen werden, es ist aber möglich, dass Seneszenz
zur Verminderung des klonogenen Überlebens beiträgt. U87 Zellen sind PTEN-defizient und
es gibt Hinweise darauf, dass der Verlust von PTEN bei Gliomzellen verstärkt zu Seneszenz
führt, wenn eine hohe Aktivität der Akt-Kinase und oxidativer Stress, zum Beispiel durch
Strahlung, zusammenkommen [233].
5.4. Neue Erkenntnisse zur Feinstruktur von DSB-Reparaturfoci
durch superauflösende Mikroskopie
Zur genaueren Untersuchung des Schädigungsprofils von 12C-Ionen-Strahlung und der DSBReparaturantwort in U87 Zellen wurden Bestrahlungsexperimente an der Ionenstrahlanlage
SNAKE der Ludwig-Maximilians-Universität München durchgeführt. Die Zellen wurden in
133
Kapitel 5: Diskussion
einem flachen Winkel mit einzelnen/wenigen Hoch-LET Ionen (∼450 keV·µm–1) beschossen und nach unterschiedlich langen Zeiträumen fixiert. Nach Immunfärbung von γH2AX
und dem pBRCA1 wurden die Proben mit einem neuartigen Mikroskop untersucht, das zwei
superauflösende Mikroskopietechniken in einem Gerät vereint. Dabei handelte es sich um
Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und eine Variante der Lokalisationsmikroskopie (SPDM), mit der es möglich ist einzelne Fluorophore zu lokalisieren. Mit Hilfe von
SIM wurde die äußere Gestalt der γH2AX und pBRCA1 Foci in 3D vermessen, während die
innere Struktur der γH2AX Foci hauptsächlich mit SPDM in 2D untersucht wurde.
5.4.1. Sekundärfoci tragen zur Wirkung von 12C-Ionen bei
Die 3D-SIM Aufnahmen zeigten die Bildung sekundärer Foci zwischen 4 – 26 h nach Bestrahlung, nachdem die meisten primären γH2AX und pBRCA1 Foci im Zuge der DSB-Reparatur
bereits verschwunden waren. Die primären und sekundären Foci unterschieden sich in mehreren Aspekten voneinander: nach 26 h waren die Sekundärfoci aufgrund ihrer kompakten
Gestalt und der weniger zerfurchten Oberfläche sphärischer als die Primärfoci. Die Sekundärfoci lagen im gesamten Zellkern verteilt vor, anstatt einem Pfad in unmittelbarer Nähe
des Ionendurchgangs zu folgen. Der Grad der Kolokalisation zwischen γH2AX- und pBRCA1
war in den Sekundärfoci höher als in den Primärfoci. Außerdem übertrafen die Sekundärfoci
die Primärfoci auf dem Höhepunkt ihrer Ausprägung in ihrer Anzahl, dem Gesamtvolumen
und der Gesamtoberfläche pro Zellkern fast um das Doppelte.
Die Sekundärfoci wiesen darauf hin, dass mindestens 4 h nach Bestrahlung neue DSB
entstanden sein müssen, die nicht unmittelbar, sondern indirekt durch den Schwerionenbeschuss verursacht wurden. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die sekundären DSBs
im Zuge der DNA-Replikation während der S-Phase aus anderen Läsionen hervorgegangen sind. Replikationsbedingte einendige DSBs sind in der Literatur gut dokumentiert [25,
49,234,235]. Ihre Entstehung trägt beispielsweise zur Zytotoxizität des Replikationshemmstoffs Hydroxyurea [25] und von UV-Strahlung [49] bei. Außerdem sind replikationsbedingte DSBs auch radiobiologisch relevant, da sie die zellabtötenden Wirkung von γ-Strahlung
verstärken [235,236]. Im vorliegenden Fall könnte ein replikationsabhängiger Entstehungsmechanismus sekundärer DSBs von noch größerer Bedeutung sein, da Schwerionenstrahlung die Bildung komplexer geclusterter DNA-Schäden fördert [20,24]. Der Effekt war bei
den 12C-Ionen-Bestrahlungen am SNAKE deutlicher ausgeprägt als bei den vorherigen Experimenten am HIT. Dies ist wahrscheinlich auf den deutlich höheren LET bei der Bestrahlungsanordnung am SNAKE zurückzuführen (∼450 keV·µm–1monoenergetisch, gegenüber
∼120 keV·µm–1durchschnittlich im spread-out Bragg-Peak am HIT).
Vereinzelte Einzelstrang- oder Basenschäden können schnell repariert werden und sind
als Ursache für die späte Entstehung sekundärer Foci eher unwahrscheinlich. Treten solche
Schäden hingegen in Clustern auf, so kann dies ihre Reparatur deutlich verlangsamen oder
gar unterbinden; vor allem bei gemischten Schäden können sich verschiedene Reparatursysteme gegenseitig behindern [226,237]. Es wird abgeschätzt, dass DSBs nur etwa 1% aller
DNA-Schäden ausmachen, die durch γ-Strahlung verursacht werden [238]; bei Schwerionenstrahlung ist dieser Anteil nicht bekannt, doch es ist davon auszugehen, dass auch dabei
Nicht-DSB-Schäden am häufigsten vorkommen.
Eine große Anzahl primärer Cluster aus Nicht-DSB-Schäden könnte die vielen sekundären
γH2AX- und pBRCA1-Foci erklären, jedoch bleibt die Frage, warum diese verteilt im Zellkern
134
Kapitel 5: Diskussion
auftauchen, anstatt nahe des Ionendurchgangs. Ein wichtiger Aspekt könnte sein, dass ausschließlich DSBs und lange Einzelstranglücken erwiesenermaßen Kontrollpunkt-abhängige
Zellzyklusblockaden auslösen [14]. Deshalb ist es möglich, dass nach der Reparatur primärer
DSBs eine Zellzyklusblockade wieder aufgehoben wird, obwohl noch geclusterte Nicht-DSBSchäden in der DNA vorhanden sind. Solche Schäden würden im Zuge von ChromatinUmlagerungen beim Übergang in die nächste Zellzyklusphase ebenfalls verlagert werden.
Tatsächlich zeigte sich bis 30 min nach Bestrahlung ein Rückgang des durchschnittlichen
Zellkern- und DNA-Volumens gegenüber den unbestrahlten Kontrollen, der sich als kurzfristige G1/S-Blockade interpretieren lässt, während signifikant erhöhte Werte auf einen
G2-Arrest nach 26 h hinweisen. Beide Beobachtungen passen zu der Hypothese, dass die
sekundären DSBs aus Nicht-DSB-Schäden hervorgehen, die über die G1/S-Grenze hinweg
existieren. Der hohe Kolokalisationsgrad zwischen sekundären pBRCA1 und γH2AX Foci
legt den Ablauf eines Homologie-basierten DSB-Reparaturmechanismus nahe [239,240].
Dies ist ein weiterer Hinweis auf replikationsbedingte Sekundärfoci, da deren Reparatur
durch nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung nicht möglich ist, und stattdessen auf der
Bruch-induzierten Replikation beruht [87]. Im Unterschied zur klassischen DSB-Reparatur
durch homologen Rekombination ist die Bruch-induzierte Replikation sehr fehleranfällig und
führt häufig zu Chromosomenaberrationen, wie Translokationen, Deletionen oder Inversionen [241,242]. Die Bedeutung von replikationsbedingten sekundären DSBs könnte daher,
insbesondere für die Strahlentherapie mit Schwerionen, größer sein, als bisher angenommen.
Zusätzlich zu replikationsbedingten sekundären DSBs besteht die Möglichkeit, dass δElektronen Sekundärschäden direkt außerhalb der Ionenflugbahn verursacht haben. Nakajima und Kollegen haben kürzlich von γH2AX Foci berichtet, die abseits der Flugbahn
schneller Eisenionen in bestrahlten Zellen zu finden waren [243]. Computersimulationen
zur DSB-Induktion durch Delta-Elektronen stimmten gut mit den Beobachtungen überein.
Die γH2AX Foci konnten unmittelbar nach Bestrahlung beobachtet werden; im Gegensatz zu
den hier diskutierten einendigen Sekundärschäden handelte es sich also um typische direkt
induzierte DSBs mit zwei Bruchenden. Ungeachtet dessen ist es sehr wahrscheinlich, dass δElektronen mit Energien, die zur DSB-Induktion ausreichen, auch mehrere andere Schäden
auf ihrem Weg durch den Zellkern hinterlassen können. Werden diese nicht schnell genug repariert, so können sie ebenfalls zu den replikationsabhängigen Sekundärfoci führen, die hier
beobachtet wurden. Es sei angemerkt, dass in der Arbeit von Nakajima und Kollegen trotz
einem Beobachtungszeitraum von bis zu 48 h keine Sekundärfoci auftraten; allerdings war
die Beobachtung replikationsbedingter Sekundärfoci aufgrund des experimentellen Ansatzes
auch nicht möglich, da gezielt Zellzyklusblockaden ausgelöst wurden, um die Wirkung der
Bestrahlung mit Eisen- und 12C-Ionen in verschiedenen Zellzyklusphasen getrennt betrachten zu können.
Theoretisch könnte auch eine langsame Verlagerung der primären DSBs zu der Beobachtung von Foci abseits der Ionenflugbahn beitragen, sofern sie über viele Stunden hinweg
nicht repariert werden können. Jakob und Kollegen konnten 2011 belegen, dass DSBs im
Heterochromatin innerhalb weniger Minuten an die Grenze zum Euchromatin verlagert werden [201]. Andererseits zeigen andere Arbeiten der selben Gruppe, dass abgesehen, von
diesen lokal begrenzten Verlagerungen, die Beweglichkeit von DSBs und assoziierten Reparaturfoci im Allgemeinen sehr gering ist [214]. Mit Hilfe von Lebendzellmikroskopie mit Live135
Kapitel 5: Diskussion
Bilderfassung maßen sie, dass sich 53BP1 Foci nach Schrägbestrahlung von U2OS Zellen mit
Nickelionen innerhalb von 12 h durchschnittlich nur 2 – 3µm von ihren Entstehungsort entfernen. Es ist allerdings denkbar, dass die Beweglichkeit nur bei DSBs so stark eingeschränkt
ist, die durch nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung repariert werden, da hierbei die Bruchenden durch DNA-PK sehr eng zusammengehalten werden. In G2-Zellen, bei denen auch
homologe Rekombination als Reparaturweg in Frage kommt, wird die schnelle Komponente der Reparaturkinetik (innerhalb von etwa 2 h nach DSB-Induktion) mit nicht-homologer
End-zu-End-Verknüpfung in Verbindung gebracht, die langsame Komponente (Reparaturdauer >2 h) hingegen mit homologer Rekombination [94,95]. Folglich besteht die Möglichkeit,
dass sich länger vorhandene DSBs nicht nur weiter von ihrem Entstehungsort entfernen können, weil sie länger dafür Zeit haben, sondern auch, weil ihr Reparaturmechanismus ihnen
mehr Bewegungsfreiheit erlaubt. Dies könnte die immer größer werdenden Abweichungen
der Foci-Positionen von geraden Ionenflugbahnen erklären, die sich zwischen 1 h und 4 h
nach Bestrahlung zeigten.
Auch wenn anzunehmen ist, dass die beobachteten Sekundärfoci auf replikationsbedingte DSBs hinweisen, kann nicht völlig ausgeschlossen werden, dass sie durch andere Mechanismen hervorgerufen wurden, die nicht zwingend mit verbleibenden DNA-Schäden in
Verbindung stehen müssen. Es ist bekannt, dass sich γH2AX Foci auch in Abwesenheit von
DSBs bilden können, und dass die Menge der H2AX-Phosphorylierung im Zellzyklus-Verlauf
schwankt [244]. Beispielsweise lässt sich nach UV-Bestrahlung pan-nukleäres γH2AX während der G1- und S-Phase beobachten, das nicht mit DSBs, sondern der Nukleotidexzisionsreparatur assoziiert ist [47,219]. Es ist noch nicht geklärt, welche Bedeutung die H2AXPhosphorylierung unter physiologischen Bedingungen hat. Bemerkenswert ist aber, dass sie
vor allem an besonders bruchanfälligen Stellen im Chromatin zu finden ist, weswegen vermutet wird, dass γH2AX auch in Abwesenheit von DSBs eine Rolle bei der Wahrung der
genomischen Integrität spielt [245]. Es wäre durchaus möglich, dass ein solcher Mechanismus in einer Zelle aktiviert wird, die erfolgreich eine erhebliche Schädigung ihrer DNA
überstanden hat, insbesondere wenn eine Hemmung der Apoptose vorliegt, wie im Fall der
hier untersuchten Glioblastomzelllinie.
5.4.2. γH2AX-Foci bestehen aus vielen kleineren Subfoci
Schwerionenstrahlung induziert größere γH2AX als Photonenstrahlung [202]; Die Aufklärung der inneren Struktur von γH2AX Foci könnte dabei helfen, zu verstehen, warum das so
ist, und möglicherweise zu einem tieferen Verständnis des unterschiedlichen Schädigungspotentials beider Strahlenqualitäten führen. Aufgrund des eingeschränkten Auflösungsvermögens lassen konventionelle Mikroskopietechniken, inklusive der Konfokalmikroskopie jedoch
nur vage Mutmaßungen über den Aufbau der Foci zu. Mit Hilfe von Bildentfaltung konnten Nakajima und Kollegen kürzlich zeigen, dass durch Schwerionen induzierte γH2AX Foci
mehrere Zentren erhöhter Intensität aufweisen [243]. Wir konnten diesen Befund durch superauflösende Mikroskopie bestätigen. Die SPDM-Methode erlaubte es uns darüber hinaus,
einzelne γH2AX Subfoci mit hoher Genauigkeit zu unterscheiden und zu vermessen.
Die Betrachtung der einzelnen Ebenen in den 3D-SIM-Aufnahmen zeigte, dass die γH2AX
Foci nach Bestrahlung mit 12C-Ionen eine Feinstruktur aufweisen, die an gewundene Ketten aus annähernd runden Objekten erinnern. Durch Überlagerung der SIM-Aufnahmen mit
noch höher aufgelösten SPDM-Bildern in der übereinstimmenden Bildebene, traten weitere
136
Kapitel 5: Diskussion
Strukturdetails zu Tage, die den Eindruck von eng aneinandergereihten Subfoci bestärkte.
Zur quantitativen Auswertung wurden die Positionsinformationen der γH2AX-Signale aus
den SPDM-Aufnahmen herangezogen. Eine Dichte-basierte Clusteranalyse ergab, dass sich
1 h nach Bestrahlung durchschnittlich 93 Subfoci innerhalb der Foci-Regionen befanden,
und weitere 113 im restlichen Zellkern. Das Aufkommen der sekundären Foci nach 26 h war
ebenfalls von einer steigenden Subfoci-Anzahl innerhalb, jedoch nicht außerhalb der Foci,
begleitet. Die weiteren Untersuchungen zeigten, dass sich die Größe und Signalanzahl der
Subfoci während der Reparatur nur wenig änderte; beide Werte waren innerhalb der Foci
größer als außerhalb. Tendenziell zeigte sich, dass die Subfoci während der Reparatur etwas
kleiner wurden und zwischen 4 und 26 h wieder zunahmen. Dabei blieben die Subfoci außerhalb der Foci-Regionen annähernd kreisrund und die innen liegenden wurden zunehmend
länglicher.
Der flächenäquivalente Kreisdurchmesser der Subfoci betrug durchschnittlich 113 nm innerhalb der Foci und 90 nm außerhalb. Die geringe Änderung dieser Werte während der Reparatur lassen vermuten, dass die Subfoci die grundlegenden Einheiten der großen γH2AX
Foci darstellen. Übereinstimmend haben Bewersdorf und Kollegen 2006 abgeschätzt, dass
bereits das unphosphorylierte H2AX in Clustern mit ∼100 nm Durchmesser vorliegt [246].
Die Autoren benutzten für ihre Messungen 4Pi-Miksokopie, die ebenfalls zu den superauflösenden Techniken zählt. Auch die Größe von γH2AX Foci nach Bestrahlung mit Photonen
wurde untersucht. Im Unterschied zu den hier verwendeten Methoden, verbessert ein 4PiMikroskop die Auflösung jedoch entlang der optischen Achse und nicht lateral. Deshalb war
es nicht möglich genauere Angaben zum inneren Aufbau der γH2AX Foci zu erhalten.
Da das γH2AX in den Nukleosomen vorkommt, zeichnet die Färbung Abschnitte der lokalen Chromatinstruktur nach. Einige der besonders längliche Subfoci in den Foci-Regionen
wiesen eine Dicke von 40 – 60 nm auf. Berücksichtigt man die Lokalisationsgenauigkeit der
Fluoreszenzsignale (ca. 15 nm), sowie die Größe der Antikörper für die γH2AX-Markierung,
so liegt dieser Wert in der Größenordnung einzelner Nukleosomen (ca. 11 nm). Auch die
gewundene Form der Subfoci und die Lücken zwischen ihnen sprechen dafür, dass sie aus
Nukleosomen bestehen, die entlang der Chromatinfaser eng benachbart sind. Ob diese Einheiten Reparaturcluster oder einzelne DSBs repräsentieren, lässt sich nicht ohne weitere
Untersuchungen angeben. Prinzipiell könnte die Substruktur der Foci auch durch lokale
Unterschiede im Chromatinstatus hervorgerufen werden, wodurch stellenweise die H2AXPhosphorylierung eingeschränkt wird. Die wohl definierte Größe und Gestalt der Subfoci
sprechen aber gegen diese Interpretation.
5.4.3. 12C-Ionen verursachen H2AX- und BRCA1-Phosphorylierung auch abseits
ihrer Flugbahn
Neben den großen Foci und den Subfoci, traten unmittelbar nach Schrägbestrahlung mit 12CIonen auch kleine, aber helle γH2AX- und pBRCA1-Signale abseits der Ionenflugbahn auf. Sie
verteilten sich ohne erkennbare Ordnung im gesamten Zellkern und waren, im Gegensatz zu
den spärlich in unbestrahlten U87 Zellen beobachteten Hintergrundsignalen, deutlich heller
und zahlreicher. Weiterhin zeigten sie keine Kolokalisation zwischen γH2AX und pBRCA1.
Die kleinen γH2AX-Signale dominierten zu den frühen Zeitpunkten nach der Bestrahlung
und verschwanden großteils mit dem Aufkommen der Sekundärfoci nach 26 h.
In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen berichten auch Nakajima und Kollegen
137
Kapitel 5: Diskussion
[243] von γH2AX-Signalen, die abseits der Ionenflugbahn entstehen und im Gegensatz zu
den Foci entlang der Ionenspur kleiner und weniger strukturiert sind (sie enthielten weniger Intensitätszentren). Die Autoren führen diese „Off-track-Signale“ auf DSBs zurück, die
durch δ-Elektronen entstanden sind. In unserem Fall ist es unwahrscheinlich, dass sich alle
abseits der Ionenflugbahn gelegenen γH2AX-Signale auf diese Weise erklären lassen: In den
Experimenten von Nakajima und Kollegen fanden sich nur 2 – 5 solcher Signale nach Bestrahlung mit Eisenionen, übereinstimmend mit den Ergebnissen aus Computersimulationen
der DSB-Induktion durch δ-Elektronen. Im vorliegenden Fall wurden deutlich mehr Signale
abseits der Ionenspur gefunden, obwohl die Reichweite der δ-Elektronen aufgrund des höheren LETs der 12C-Ionen (450 keV·µm–1) gegenüber den Eisenionen (200 keV·µm–1) deutlich
geringer war (<1 µm statt 2 mm nach einem Modell der Ionisationsstruktur von Kiefer et
al. [247]). Es erscheint daher fraglich, ob diese Signale DSBs repräsentieren.
Stattdessen könnte es sich um die Feinstruktur des pan-nukleären γH2AX-Signals handeln, das bereits in Abschnitt 4.1.2 diskutiert wurde. Übereinstimmend mit der dort bereits
erwähnten Arbeit zu diesem Phänomen von Meyer et al. [220], zeigten die pan-nukleären
Signale eine ähnliche Kinetik und traten nur vorübergehen auf. Die Beobachtung von diskreten Signalen anstelle einer mehr oder weniger homogenen Fluoreszenz ist wahrscheinlich
auf die überlegene optische Auflösung des hier verwendeten Mikroskops zurückzuführen.
5.5. Potenzielle Schlussfolgerungen für die klinische
Strahlentherapie mit Schwerionen
Aus den hier erhaltenen Daten lassen sich möglicherweise neue Ansatzpunkte für die klinische Anwendung der Schwerionenstrahlung und ihrer Kombination mit chemo- oder immuntherapeutischen Strategien zur Krebsbehandlung ableiten. Es wurden Hinweise darauf
gefunden, dass die replikationsbedingte Entstehung von sekundären DSBs stärker zur Strahlenwirkung von 12C-Ionen beiträgt als bisher angenommen. Diese einendigen DSBs erfordern
eine Reparatur durch homologe Rekombination. Auch für die Beseitigung geclusterter DSBs,
die primär durch 12C-Ionen-Strahlung verursacht wurden, war die homologe Rekombination von großer Bedeutung. Insbesondere zeigte sich im Vergleich mit Photonenstrahlung
eine stärkere und länger anhaltende Aktivierung von BRCA1, einer Kernkomponente der
homologen Rekombination. Die Schwerionentherapie sollte sich daher gut zur Behandlung
von Tumoren mit BRCA1-Defizienz und anderen Defekten in der homologen Rekombination
eignen. Theoretisch könnten deshalb besonders Patienten mit genetisch bedingten Mammaoder Ovarialkarzinomen von der Schwerionentherapie profitieren [248].
Um die Relevanz der Ergebnisse für die 12C-Ionen-Therapie von Glioblastom-Patienten
zu beurteilen, muss der genetische Hintergrund der untersuchten U87 Zellen berücksichtigt
werden. Das Genom der Zelllinie wurde 2010 vollständig sequenziert und weist zahlreiche Mutationen, Insertionen, Deletionen und Translokationen auf [174]. Unter den DSBReparaturgenen ist hiervon nur MRE11B direkt betroffen (es enthält eine Mutation in einer Intron-Spleißsequenz). Die Isoform MRE11A, die für die funktionelle Nuklease Mre11
des MRN-Komplexes codiert, ist nicht verändert. Im U87 Genom sind allerdings Gene mit
Knockout-Mutationen enthalten, die sich nachweislich indirekt auf die DSB-Reparatur auswirken können, insbesondere PTEN und XPC, die beide homozygot defekt sind. XPC spielt
als Kernkomponente der GG-NER vor allem eine Rolle bei der Beseitigung von Pyrimidin138
Kapitel 5: Diskussion
Dimeren und anderen typischen UV-Schäden in transkriptionell inaktiver DNA. Für die DSBReparatur ist XPC nicht erforderlich, jedoch führt XPC-silencing in HeLa Zellen zu einer
Reduktion der DSB-Reparaturaktivität durch nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung auf
bisher ungeklärte Weise [249].
PTEN-Defizienz in Gliomzellen hat interessanterweise den gegenteiligen Effekt: PTEN ist
eine Lipid-Phosphatase, die verschiedene Phosphatidylinositole dephosphoryliert und damit
den PI3K/Akt-Signalweg hemmt. Dieser spielt bei der Karzinogenese von Gliomen und einigen weiteren Tumoren eine wichtige Rolle, da Akt das Zellüberleben nach Bestrahlung fördert und zur Entwicklung von Strahlenresistenzen beiträgt. Akt ist eine Kinase, die direkt mit
DNA-PKcs interagiert und auf diese Weise die nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung verstärkt [250]. Fehlt PTEN, so führt dies zur Hyperaktivierung von Akt und folglich der nichthomologen End-zu-End-Verknüpfung. Gleichzeitig hemmt Akt die homologe Rekombination
und die ATR-vermittelte DNA-Schadensantwort, indem es TopBP1 und Chk1 phosphoryliert
und auf indirekte Weise die Rekrutierung einiger erforderlicher Proteine an den Schadensort
hemmt (darunter RPA, BRCA1 und Rad51) [251]. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass
der Verlust von PTEN in Gliomzellen direkt die homologe Rekombination hemmt, da PTEN
die Expression von Rad51 verstärkt [252].
In diesem Zusammenhang erscheint die Kombination von 12C-Ionen-Strahlung und Temozolomid besonders in PTEN-defizienten Glioblastomen sinnvoll. Temozolomid ist ein DNAalkylierendes Agens, das zu sekundären DSBs während der Replikation führt und standardmäßig zur Chemotherapie von Glioblastom-Patienten nach konventioneller Bestrahlung mit
Photonen eingesetzt wird. Die sekundären DSBs könnten die durch 12C-Ionen-Strahlung bedingte Abhängigkeit der Zellen von der homologen Rekombination [228] weiter verstärken.
Übereinstimmend hat eine retrospektive Studie am Heidelberger Ionentherapiezentrum ergeben, dass eine Kombinationstherapie mit 12C-Ionen-Strahlung und Temozolomid Vorteile
bei der Behandlung von Patienten mit hochgradigen Gliomen bieten könnte [253]. Derzeit
wird eine solche Kombinationstherapie in einer klinischen Studie getestet [254].
In einer kürzlich erschienen Arbeit von Takahashi et al. wurde mit Hilfe von Ligase-4-, bzw.
Rad54-Knockout-Mutanten untersucht, ob die DSB-Reparatur durch nicht-homologe End-zuEnd-Verknüpfung oder homologe Rekombination entscheidend für die Sensitivität von embryonalen Fibroblasten gegenüber Hoch-LET-Strahlung ist [255]. Die Studie zeigt, dass 12Cund andere Schwerionen im Gegensatz zu Photonenstrahlung die nicht-homologe End-zuEnd-Verknüpfung beeinträchtigt. Obwohl sich dieses Ergebnis damit deckt, dass die homologe Rekombination bei 12C-Ionen-Strahlung folglich eine größere Rolle spielt als bei Photonenstrahlung, kommen die Autoren zu dem Schluss, dass die Hemmung der nicht-homologe
End-zu-End-Verknüpfung eine vielversprechendere Strategie zur begleitenden Schwerionentherapie darstellt: Die Ligase-4-defizienten Zellen zeigten gegenüber den Wildtypzellen eine
größere Steigerung der Strahlenwirkung (sensitization enhancement ratio) als die Rad54defizienten Zellen. Bemerkenswerterweise traf dies sowohl bei Schwerionen-, als auch Photonenstrahlung zu.
Da die nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung insbesondere in der G1-Phase den dominierenden DSB-Reparaturmechanismus darstellt, könnte ihre chemotherapeutische Hemmung den Vorteil bieten, dass auch ruhende oder langsam proliferierende Tumorstammzellen betroffen sind, die oftmals eine hohe Strahlenresistenz aufweisen [255]. Es kann jedoch
nicht sicher beantwortet werden, ob eine solche Strategie aufgrund der zu erwartenden Ne139
Kapitel 5: Diskussion
benwirkungen tatsächlich einen therapeutischen Nutzen hätte: Ein Großteil aller Körperzellen ist ebenfalls auf die nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung angewiesen und aufgrund
der Bedeutung der nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfung für die V(D)J-Rekombination
wäre von einer Immunsupprimierung auszugehen.
Ob in den hier untersuchten Glioblastomzellen trotz der großen Bedeutung der homologen
Rekombination bei 12C-Ionen-Strahlung auch die nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung
die Strahlensensitivität maßgeblich beeinflusst, ist nicht bekannt; es gibt zwar Hinweise darauf, dass die nicht-homologe End-zu-End-Verknüpfung auch außerhalb der G1-Phase den ersten Reparaturansatz darstellt, jedoch bedeutet das nicht unbedingt, dass die Reparatur auch
hierdurch abgeschlossen wird [93]. So zeigen Untersuchungen zur Aktivität der Nuklease
CtIP und des Einzelstrang-Bindeproteins RPA, dass speziell nach Hoch-LET Bestrahlung mit
Schwerionen bei ∼85% aller mit γH2AX markierten DSB-Foci eine ausgedehnte Resektion
der Bruchenden stattfindet [228]. Dies verhindert den Abschluss der Reparatur durch nichthomologe End-zu-End-Verknüpfung und fördert die homologe Rekombination [95]. Bemerkenswerterweise konnte auch in der G1-Phase in bis zu 40% der DSB-Foci End-Resektion
nachgewiesen werden [228]. Da während der G1-Phase keine Schwesterchromatiden für die
homologe Rekombination zur Verfügung stehen, greifen die Zellen in solchen Situationen
offenbar auf alternative DSB-Reparaturmechanismen zurück [228].
Entsprechende „Backup“-Mechanismen zur nicht-homologen Enz-zu-End-Verknüpfung (BNHEJ) beruhen zumindest teilweise auf Mikrohomologien zwischen den Bruchenden [85].
Sie erfordern einen gewissen Grad der End-Resektion, sowie vermutlich einige Enzyme,
die auch für die homologen Rekombination relevant sind, darunter PARP und Ligase III
[84]. Zellzyklusspezifische Untersuchungen haben ergeben, dass nach Photonenstrahlung
die meisten DSBs durch B-NHEJ repariert werden, wenn Defekte in der DNA-PK-abhängigen
nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfung (D-NHEJ) vorliegen [84,256]. Auch in der G2Phase wurde B-NHEJ bevorzugt vor der homologen Rekombination benutzt. Wang und Kollegen konnten zeigen, dass Hoch-LET-Strahlung (in diesem Fall Eisenionen) speziell die DNHEJ hemmt, nicht jedoch die B-NHEJ oder die homologe Rekombination [232]. Kleine
DNA-Fragmente (<40 bp), die durch geclusterte DSBs entstehen, könnten dafür verantwortlich sein, weil sie speziell die Bindeeffizienz der für D-NHEJ unerlässlichen Ku-Proteine stark
beeinflussen [257]. Vor diesem Hintergrund erscheint der Einsatz von PARP-Inhibitoren in
Kombination mit 12C-Ionen-Strahlung sinnvoll. Neben der Hemmung von B-NHEJ fördert
PARP-Inhibition die Entstehung von sekundären DSBs, weil PARP auch für die Erkennung
von Einzelstrangbrüchen wichtig ist, die zu Replikationsblockaden führen können [27,252].
Auf diese Weise könnte eventuell das Konzept der synthetischen Letalität mit den Vorteilen der Schwerionentherapie in Bezug auf biologische Wirksamkeit und Tumorkonformität
kombiniert werden.
Inwieweit sich diese Analysen und Überlegungen aus der Zellkultur klinisch auswirken,
muss letztendlich im Rahmen von klinischen Studien mit Patienten überprüft werden.
Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit Grundlagen für die unterschiedliche
Wirksamkeit von 12C-Ionen- und Photonenstrahlung aufgedeckt und optisch sichtbar gemacht, sowie neue Erkenntnisse zur Entstehung und Reparatur von Doppelstrangbrüchen
durch ionisierende Strahlung gefunden. Diese Themen sind nicht nur für die radiobiologische Grundlagenforschung, sondern auch im Rahmen der klinischen Strahlentherapie und
140
Kapitel 5: Diskussion
des Strahlenschutzes von Bedeutung. Durch Verwendung von superauflösender Mikroskopie
und Weiterentwicklung relevanter Auswertungssoftware wurde ein Beitrag dazu geleistet,
dass diese noch relativ junge Disziplin der Optik Einzug in die radiobiologische Forschung
hält. Die Ergebnisse zur Feinstruktur der DSB-Reparaturfoci lassen nur grob erahnen, welch
großes Potenzial die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie auch für andere Forschungsgebiete noch bereit hält; So bedeutete es allgemein für die Anwendung dieser Methoden in
der Biologie eine große Ermutigung, dass jüngst im Jahr 2014 Eric Betzig, Stefan W. Hell und
William E. Moerner für ihre Beiträge zur Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurden.
141
A ANHANG
A.1. MATLAB Algorithmen
Dieser Abschnitt enthält die Dokumentation zu den MATLAB-Funktionen, die in dieser Arbeit implementiert wurden, um Daten auszuwerten, die mit superauflösender Mikroskopie
gewonnen wurden. Die Funktionen und alle erforderlichen Zusatzdateien wurden auf einer
Online-Plattform zum Austausch von Quellcodes für superauflösende Mikroskopie veröffentlicht. Sie ist unter https://code.iri.uni-frankfurt.de/trac/microscopy/ zu erreichen.
Sämtliche Informationen sind im Code der einzelnen Funktionen kommentiert, und können auch über die Hilfefunktion von MATLAB abgerufen werden. Hier sind Variablen blau
hervorgehoben und <1xN Typ> bezeichnet die Dimensionalität und den Datentyp einer Variablen; in Anlehnung an MATLAB werden mehrere Dimensionen durch x getrennt und Zahlen geben die Anzahl der Elemente in jeder Dimension an. Großbuchstaben stehen für eine
beliebige, bzw. nicht festgelegte Anzahl an Elementen. In einigen Fällen sind unterschiedlich
viele Dimensionen möglich, die dann in runden Klammern stehen.
Bei numerischen Datentypen steht numerical für einen beliebigen Zahlentyp und uint
für einen vorzeichenlosen Ganzzahlentyp. Alle explizit angegebenen numerischen Datentypen beziehen sich auf den typischerweise erwarteten Wertebereich; mächtigere Datentypen
können ebenfalls verwendet werden, jedoch sind dann Werte außerhalb des erwarteten Bereichs zu vermeiden, da es sonst i.d.R. zu Informationsverlust kommt. Insbesondere sollte die
Unterscheidung zwischen Fließkomma-Zahlentypen, vorzeichenlosen und vorzeichenbehafteten Ganzzahlentypen beachtet werden.
A.1.1. Allgemeine Funktionen 
GetSpecFiles
Syntax:
[files] = GetSpecFiles(inPath, searchStr)
Description:
Lists the files in the folder inPath that match to the name pattern(s)
defined in searchStr.
Input:
inPath <1xN char> complete path of input folder incl. final ’\’
searchStr <1xN cell> containing N filename patterns as <1xN char>. The wildcard
character ’*’ is allowed.
Example: searchStr = {’568*’, ’488*’, 404*’} could be used to list images
named after the laser lines used for acquisition.
Output:
files <1xN cell> containing N lists with the matching filenames as . No
list is added, if no match is found for a particular pattern; the empty
cell is returned if no matches are found. 
142
Anhang
 
WriteOVkdf2tif
Syntax:
[] = WriteOVkdf2tif(inPath, fnPattern, outPath)
Description:
Reads all KDF images matching the filename pattern fnPattern in the folder inPath and
saves them as 8 bit TIFF files into the folder outPath. Intended to convert overview
images e.g. showing the roi of an SPDM acquisition into a TIFF file that can be viewed
with any ordinary image viewer.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern without extension; input files are named
’*fnPattern.kdf’, output files ’*fnPattern.tif’
outPath <1xN char> path of output folder 
Grundlegende Ein- und Ausgabefunktionen 
ReadImgRGB2GS
Syntax:
[res] = ReadImgRGB2GS(filename)
Description:
Reads 2D or 3D KDF grayscale images, or 2D images of any filetype supported by MATLAB’s
’imread’ function (TIFF, BMP, JPG, GIF, PNG, ...). In the latter case ’RGB’ images are
converted to grayscale. Other color models like CMYK should not be used, as they might
not be converted to grayscale correctly (mean of all samples/pixel is used for grayscale conversion).
Input:
filename <1xN char> complete path and filename, incl. extension
Output:
res 3D grayscale image  
ReadImgs2Stack
Syntax:
[res] = ReadImgs2Stack(inPath, fnPattern)
Description:
Creates an image stack from grayscale or color images matching the filename pattern
fnPattern in the folder inPath and returns the stack. Supports various image formats
(see ’imread’ documentation).
Input:
inPath <1xN char> input folder, incl. final file separator
fnPattern <1xN char> filename pattern
Output:
res image stack  
ReadImgStack
Syntax:
[res] = ReadImgStack(filename)
Description:
Reads grayscale or color 3D images of various formats (see ’imread’ documentation).
143
Anhang
Input:
filename <1xN char> complete path and filename of image file
Output:
res image stack  
ReadKDF
Syntax:
[res] = ReadKDF(filename)
Description:
Reads 2D or 3D grayscale KDF images (based on ’ReadKhorosData’).
Input:
filename <1xN char> complete path and filename of input file, incl. ’.kdf’
Output:
res 2D or 3D grayscale image  
WriteAlphaNumTiffs
Syntax:
[] = WriteAlphaNumTiffs(imgStack, outPath, fileID)
Description:
Saves the 3D grayscale image stack imgStack as a sequence of 2D TIFF files in the
folder outPath. The files are named ’fileID000.tif’, ’fileID001.tif’, ’fileID002.tif’,
... (based on a template from Gerrit Best).
Input:
imgStack 3D grayscale image
outPath <1xN char> path of output folder
fileID <1xN char> output file identifier (beginning of the filenames)  
WriteKDF
Syntax:
[success] = WriteKDF(image, outPath, filename)
Description:
Writes KDF images into the specified file in the folder outPath (based on
’WriteKhorosData’). Eventually ocurring errors are caught and logged in the global
variable errLog.
Input:
image containing the image data (can be a 2D or 3D grayscale
image)
outPath <1xN char> path of output folder
filename <1xN char> name of output file, incl. ’.kdf’
Output:
success Returns 1 if successful OR 0 otherwise  
WriteTiffImage
Syntax:
[success] = WriteTiffImage(image, outPath, filename, method)
Description:
Writes image into the TIFF file filename in the folder outPath, using the given method.
144
Anhang
Input:
image OR containing the image data (can
be a 2D or 3D grayscale or color image)
outPath <1xN char> path of output folder
filename <1xN char> name of image file, incl. ’.tif’
method if == 1: uses ’imwrite’ to actually write the file
-> supports 2D grayscale and 2D or 3D color images
-> no support
-> Lossless ’LZW’ compression
if == 2: uses ’writeim’ to actually write the file
-> supports 2D- and 3D-grayscale images
-> supports
-> no compression
Output:
success Returns 1 if successful OR 0 otherwise 
Batchfunktionen 
BatchFilesInFolder
Syntax:
[] = BatchFilesInFolder(inPath, fnPattern, outPath, funHndl, varargin)
Description:
Batch function for ’SaveSPDMres’ and functions with similar interfaces (functions that
process single files instead of whole folders).
Reads all files matching the filename pattern fnPattern and passes them to the function
with the given handle funHndl. Result files are written to the folder outPath.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process mulitple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern
outPath <1xN char> path of output folder
funHndl of the function to process in batch mode
varargin <1xN cell> containing extra parameters for the respective function besides
inPath, fnPattern and outPath  
BatchFolders
Syntax:
[] = BatchFolders(inPath, fnPattern, outPath, resFN, funHndl, keepFolderTree, varargin)
Description:
General batch function for multi-folder-processing. Calls the function with the handle
funHndl for all folders and subfolders of the folder inPath. Results are written into
the folder outPath, either directly (if keepFolderTree == 0), or using subfolders
corresponding to the input folder tree (if keepFolderTree == 1). Useful for batch
processing of ’PrepareSIMrecon’, ’OrteDriftCorrection’, ’SPDMdriftCorrection’,
’BatchCorrectSIMbleach’, ..., and not to forget ’BatchFilesInFolder’, another batch
function for multi-file processing in a single folder.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern
outPath <1xN char> path of output folder
resFN <1xN char> filename of batch result file OR 0 if no such file should
be written
funHndl of the function to process in batch mode
keepFolderTree <1x1 logical> either false (0) if results should be written directly
to outPath, OR true (1), if subfolders corresponding to the input
folder tree should be used (within outPath).
145
Anhang
varargin <1xN cell> containing extra parameters for the respective function
besides inPath, fnPattern and outPath  
BatchFoldersToFiles
Syntax:
[] = BatchFoldersToFiles(inPath, fnPattern, outPath, resFN, funHndl, varargin)
Description:
Batch function for ’CreateResultFiles’ and functions with similar interfaces. Reads
files from different folders and writes the results into the folder outPath, using the
source folder name as the fileID (beginning) of the target file name.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern
outPath <1xN char> path of output folder
resFN <1xN char> filename of batch result file OR 0 if no such file should be
written
funHndl of the function to process in batch mode
varargin <1xN cell> containing extra parameters for the respective function besides
inPath, fnPattern and outPath  
BatchMeasure
Syntax:
[] = BatchMeasure(inPath, fnPattern, outPath, funHndl, varargin)
Description:
Batch function for ’CollectIntInfo’, ’CollectIntInfoSIMacq’, ’PixelsAboveTH’ and
functions with a similar interface. Such functions perform measurements on all images
within a folder matching the filename pattern fnPattern and return the results as a
that can be saved to a result file using the ’SaveMeasurements’ function.
Also these functions set the <1xN char> global variable measurementLabels to contain a
comma-separated list of labels for each measurement it performs. ’BatchMeasure’ reads a
folder and all of its subfolders and writes the results into a corresponding folder
tree within outPath.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern
outPath <1xN char> path of output folder
funHndl of the measurement function to process in batch mode
varargin <1xN cell> containing extra parameters for the respective function besides
inPath, fnPattern and outPath 
Bildkorrektur 
CorrectShift
Syntax:
[optRef, optRes, s] = CorrectShift(refImg, shiftedImg, useCuda, varargin)
Description:
Corrects the shift s between the two grayscale images refImg and shiftedImg that show
corresponding structure features. If the input images have different sizes in x or y
direction, shiftedImg will be scaled to fit the x/y size of refImg and eventual juts
are clipped in both images (using ’MatchImgSizes’); in this case the pixel sizes need
to be provided in varargin (see Input).
Works for 2D images, image stacks and combinations as follows:
- if both images are 2D or both images are 3D: shiftedImg is shifted back to match
refImg with subpixel accuracy and parts sticking out are clipped in both images. 3D
images must agree in the number of z-planes and voxel depth (uses
146
Anhang
’CorrectShiftEqualDims’). Returns the shift corrected images and the shift vector s
relative to refImg, in the order x;y(;z)
- if one image is 2D and the other 3D: the best matching z-plane in the 3D image is
determined with subvoxel accuracy, using a minimization algorithm and linear z-plane
interpolation; 2D shift correction and jut clipping is included in this process (uses
’CorrectShiftMatchZ’). Returns the resulting 2D plane from the 3D image, the clipped
2D input image and the shift vector s, where s(1) is the shift in x, s(2) the shift
in y (both relative to refImg) and s(3) is the position of the interpolated z-plane
in the 3D image (1-based indexing)
Prepared for CudaMat usage (fast execution on the GPU of a graphics card that supports
CUDA; toolbox by Rainer Heintzmann). See http://www.nanoimaging.uni-jena.de/CudaMat for
further information.
Input:
refImg reference image
shiftedImg shifted image
useCuda <1x1 logical> use CudaMat (true) or don’t (false)
varargin <1x2 cell> (optional) containing the pixel sizes of both images in a
<1x1 numerical> as follows: varargin = {pxSizeRefImg, pxSizeShiftedImg}
pxSizeRefImg pixel size of refImg in nm
pxSizeShiftedImg pixel size of shiftedImg in nm
If used, both pixel sizes need to be provided
Output:
optRef refImg cropped to fit the final size of optRes
optRes shiftedImg after shift correction relative to refImg
and clipping of juts
s 2x1 double 2D or 3x1 double 3D shift vector  
CorrectShiftEqualDims
Syntax:
[resRefImg, resShiftedImg, s] = CorrectShiftEqualDims(refImg, shiftedImg)
Description:
Determines the shift between two images refImg and shiftedImg with the same dimensionalities (eighter 1D, 2D, or 3D of equal size) and corrects it by shifting back
shiftedImg. Resulting juts are cropped and intensities are scaled to 8 bit in both
images (negative values are clipped).
Returns the result images resRefImg and resShiftedImg and the shift vector s.
Prepared for CudaMat usage (fast execution on the GPU of a graphics card that supports
CUDA; toolbox by Rainer Heintzmann). See http://www.nanoimaging.uni-jena.de/CudaMat for
further information.
Input:
refImg OR reference image
shiftedImg OR image to correct
Output:
resRefImg refImg cropped to fit the final size of
resShiftedImg
resShiftedImg shiftedImg after shift correction and clipping of
juts (relative to refImg)
s 1,2 or 3-dimensional shift vector found between refImg and
shiftedImg (relative to refImg) before correction  
CorrectShiftMatchZ
Syntax:
[optRef, optRes, optZPos, shift2D] = CorrectShiftMatchZ(refImg, zStack)
Description:
Interpolates image planes from the 3D image stack zStack to find the best match for the
2D reference image refImg. Shifts in the xy-plane are taken into account and corrected
in the interpolated image.
Returns the interpolated and 2D shift corrected image plane optRes, its z-position
within the stack optZPos and the 2D shift vector optShift2D. Also returns the reference
147
Anhang
image cropped to fit the final size of optRes.
Uses CudaMat, if available (fast execution on the GPU of a graphics card that supports
CUDA; toolbox by Rainer Heintzmann). See http://www.nanoimaging.uni-jena.de/CudaMat for
further information.
Input:
refImg OR 2D reference image
zStack OR 3D image stack
Output:
optRef refImg cropped to fit the final size of its corresponding
image plane in zStack
optRes image plane interpolated from zStack that matches refImg
with subpixel accuracy. Shifts in 2D are corrected and juts are cropped
optZPos <1x1 double> z-position of optRes within zStack with subpixel accuracy (1based indexing)
shift2D <2x1 double> 2D shift vector (x,y) found between refImg and its corresponding z-plane in zStack (relative to refImg) before correction  
GetDriftVec
Syntax:
[res, preCorr, postCorr] = GetDriftVec(t0img, t1img)
Description:
Determines a drift vector based on two 2D-images acquired at different timepoints.
Supports KDF (Khoros Data Format) and various other image formats (TIFF, BMP, JPG, GIF,
PNG, ...); see documentation of MATLAB’s ’imread’ fuction for further details. RGB
images are supported, but will be converted to grayscale for shift determination. Other
color models like CMYK should not be used, as they might not be converted to grayscale
correctly (mean of all samples/pixel is used for grayscale conversion). Mixing formats
is possible but not recommended, as differences in bitdepth can lead to inaccuracies.
Input:
t0img <1xN char> complete path and filename of first image (t0)
t1img <1xN char> complete path and filename of second image (t1)
Output:
res <1x1 struct>: res.xDrift <1x1 double> linear drift velocity in x-direction
in pixel/second
res.yDrift <1x1 double> linear drift velocity in y-direction
in pixel/second
preCorr RGB overlay with R=first image and G=second image before
drift correction
postCorr RGB overlay with R=first image and G=second image after drift
correction  
MatchImgSizes
Syntax:
[res0, res1] = MatchImgSizes(img0, img1, pxSize0, pxSize1, jutHandling)
Description:
Returns two images of the same size, based on the two 2D or 3D images img0 and img1.
img1 is scaled to fit the pixel size of img0 and juts are either filled with zeros in
the smaller image or cropped (only in x- and y-direction) in the larger image, depending on the method chosen in jutHandling.
Input:
img0 (reference) image
img1 second image
pxSize0 <1x1 numerical> (reference) pixel size of img0 in nm
pxSize1 <1x1 numerical> pixel size of img1 in nm
jutHandling either of the following strings defining how to handle image parts that
stick out after resizing img1:
’pad’ juts are filled with zeros in the smaller image, centering the
image between the padding (with pixel accuracy)
148
Anhang
’padL’ juts are filled with zeros at the lower bounds (left/top side) of
the smaller image
’padU’ juts are filled with zeros at the upper bounds (right/bottom
side) of the smaller image
’crop’ juts are cropped in the larger image, removing preferentially
equal parts from both bounds of each direction (with pixel
accuracy)
’cropL’ juts are cropped at the lower bounds (left/top side) of the
larger image
’cropU’ juts are cropped at the upper bounds (right/bottom side) of the
larger image
Output:
res0 result image of img0
res1 result image of img1 
Bildanalyse 
CollectIntInfo
Syntax:
[res] = CollectIntInfo(inPath, fnPattern, outPath, meanBG)
Description:
Collects intensity information from images that match the filename pattern fnPattern in
the folder inPath. Returns the gathered information as a cell array and optionally
writes it to comma-separated text files named ’IntInfo_fnPattern.txt’.
Batch processing: Use ’BatchMeasure’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern, incl. extension; input files are named
’*fnPattern’
outPath <1xN char> path of output folder OR 0 if no result file should be written
meanBG <1x1 numerical> mean background value (estimation of camera noise) subtracted from each pixel before the measurement OR an empty array. In the
latter case the images must be 3D and the mean background is calculated by
averaging all pixels of the 1st image plane, which is excluded from the
measurement. (The 1st plane is not excluded if a numerical value is provided).
Output:
res <8xN cell> containing the following information for N image files:
info{1} <1x1 cell> containing sample identifiers as <1xN char>
info{2} <1x1 double> minimal intensity (darkest pixel)
info{3} <1x1 double> mean intensity
info{4} <1x1 double> maximal intensity (brightest pixel)
info{5} <1x1 double> sum of all intensities
info{6} <1x1 double> mean background intensity (either set by the user or
calculated from a camera noise image)
info{7} <1x1 double> number of pixels
info{8} <1x1 double> background corrected intensity sum  
PixelsAboveTH
Syntax:
[res] = PixelsAboveTH(inPath, fnPattern, outPath, TH)
Description:
Determines the number of pixels with an intensity > the threshold value TH in all images that match the filename pattern fnPattern in the folder inPath. Returns the results
as a cell array and optionally writes them to the comma-separated text file
’PixelsAbove_TH.txt’.
Batch processing: Use ’BatchMeasure’ to process multiple folders.
149
Anhang
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern, incl. extension; input files are named
’*fnPattern’
outPath <1xN char> path of output folder OR 0 if no result file should be written
TH <1x1 numerical> intensity threshold
Output:
res <2xN cell> containing the following information for N image files:
info{1} <1x1 cell> containing sample identifiers as <1xN char>
info{2} <1x1 double> number of pixels with an intensity above TH  
SaveMeasurements
Syntax:
[] = SaveMeasurements(info, labels, filename)
Description:
Writes image measurements performed with functions like ’CollectIntInfo’,
’CollectIntInfoSIMacq’ or ’PixelsAboveTH’ to the comma-separated text file filename.
Input:
info containing measurements for N image files:
info{1} <1x1 cell> containing sample identifiers as <1xN char>
info{2:M} <1x1 double> measurement results
labels <1xN char> containing comma-separated measurement labels for all measurements included in info
filename <1xN char> complete path and filename of output file, incl. extension (e.g.
’.txt’ or ’.cvs’) 
A.1.2. Funktionen für 3D-Weitfeldbilder 
FindSharpestPlane
Syntax:
[res] = FindSharpestPlane(imgStack)
Description:
Returns the sharpest z-plane (highest amount of structure information) in the 3D grayscale image imgStack. Based on a frequency filter in the fourier domain.
Input:
imgStack 3D image stack
Output:
res <1x1 uint> index of sharpest z-plane (1-based) 
Batchfunktionen 
DeconvolveDir
Syntax:
[] = DeconvolveDir(inPath, fnPattern, outPath, varargin)
Description:
Deconvolves all 3D images matching the filename pattern fnPattern in the folder inPath,
using the function ’Deconvolve’ and writes the results into the folder outPath. The
result filenames are constructed from the names of the input folder, the individual
input filenames and the deconvolution method (see ’Deconvolve’).
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
150
Anhang
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern, incl. extension; input files are named
’*fnPattern’
outPath <1xN char> path of output folder
varargin <1xN cell> (optional): varargin = {nIter, method}
nIter <1x1 uint> numer of iterations. Default: 20
method <1xN char> either ’Poisson’ or ’LeastSqr’ (see documentation of
’GenericDeconvolution’). Default: ’LeastSqr’ 
Bildkorrektur 
Deconvolve
Syntax:
[res] = Deconvolve(filename, outPath, varargin)
Description:
Deconvolves the 3D grayscale image file filename using ’GenericDeconvolution’ by Rainer
Heinzmann. Deconvolution is based on a simulated psf that takes several optical parameters into account; these are hard-coded at the moment - PLEASE ADJUST FOR YOUR SETUP!
(Should be read from adequate acquisition log files, someday).
Supports KDF (Khoros Data Format) and various other image formats (TIFF, BMP, JPG, GIF,
PNG, ...); see documentation of MATLAB’s ’imread’ fuction for further details.
Different deconvolution methods are available and the number of iterations can be
varied, using the optional varargin argument (see Input). Set the global variable
TestOptIt to 1 to optimize these settings: writesthe results of each iteration to a
TIFF file.
Batch processing: Use ’DeconvolveDir’ to process a whole folder and ’BatchFolders’ to
call ’DeconvolveDir’ for multiple folders.
Uses CudaMat, if available (fast execution on the GPU of a graphics card that supports
CUDA; toolbox by Rainer Heintzmann). See http://www.nanoimaging.uni-jena.de/CudaMat for
further information.
Input:
filename <1xN char> complete path and filename of the input file, incl. extension
outPath <1xN char> OR 0 (see below).
If TestOptIt is activated, the TIFF files for each iteration are saved in
the folder ’DeconvolutionTest’ under outPath, if outPath is a path OR the
folder of the input file, if outPath==0
varargin <1xN cell> (optional): varargin={nIter, method, fileID}
nIter <1x1 uint> numer of iterations. Default: 20
method <1xN char> either ’Poisson’ or ’LeastSqr’ (see documentation of
’GenericDeconvolution’. Default: ’LeastSqr’
fileID <1xN char> output file identifier (beginning of filename). Default:
the input filename without folder path and extension
Output:
res if outPath == 0: returns the deconvolved image stack as
if outPath is a valid folder path: writes the result to the TIFF file
’outPath\fileID_method_nIter.tif’ and the MATLAB file
’outPath\MATLAB\fileID_Deconvolved.mat’ and returns 1 if successful or 0
otherwise. 
Visualisierung 
ImgStack2Collage
Syntax:
[res] = ImgStack2Collage(stack, columns, rows, outPath, fileID)
Description:
Arranges the image stack stack into a columns x rows collage. Ensures that all specified images are used with minimal padding:
151
Anhang
- keeps columns and adjusts rows to fit all N images specified in case rows == 0 or
columns*rows < N
- keeps rows and adjusts columns if columns == 0
- shrinks columns and rows in case columns*rows > N to just include all N images,
keeping the ratio columns/rows as good as possible
- includes black padding images in the last row in case that the final columns*rows > N
Input:
stack grayscale OR color image stack
columns <1x1 uint> column number preference
rows <1x1 uint> row number preference
outPath <1xN char> path of output folder OR 0
fileID <1xN char> output file identifier (beginning of filename)
Output:
res if outPath == 0: returns the collage. If outPath is a valid folder path:
writes the collage to the file ’outPath\fileID_Colcolumnsxrows.tif’ and
returns 1 if successful or 0 otherwise.  
WriteImgs2Collage
Syntax:
[res] = WriteImgs2Collage(inPath, fnPattern, outPath, columns, rows)
Description:
Reads TIFF files matching the filename pattern fnPattern in the folder inPath and
arranges them into a columns x rows collage. Then scales the intensity to full dynamic
range. Ensures that all specified images are used with minimal padding:
- keeps columns and adjusts rows to fit all N images specified in case rows == 0 or
columns*rows < N
- keeps rows and adjusts columns if columns == 0
- shrinks columns and rows in case columns*rows > N to just include all N images,
keeping the ratio columns/rows as good as possible
- includes black padding images in the last row in case that the final columns*rows > N
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern for input and output files
outPath <1xN char> path of output folder OR 0
columns <1x1 uint> column number preference
rows <1x1 uint> row number preference
Output:
res if outPath == 0: returns the collage as
if outPath is a valid folder path: writes the collage to the TIFF file
’outPath\fnPattern_Colcolumnsxrows.tif’ and returns 1 if successful or 0
otherwise. 
A.1.3. Funktionen für SIM-Aufnahmen 
sumImg
Syntax:
[res] = sumImg(stack, r, n)
Description:
Combines frames in a SIM acquisition that belong to the same z-position by building
their sum. Which frames to combine is defined by the number of corresponding frames in
the stack r and the numer of frames between them.
Input:
stack image stack containing the images to add to each other
r <1x1 uint> number of corresponding images
n <1x1 uint> number of frames between an image and its next corresponding
image
152
Anhang
Output:
res sum image stack 
Batchfunktionen 
BatchCorrectSIMbleach
Syntax:
[] = BatchCorrectSIMbleach(inPath, fnPattern, outPath, nChannels, nDirs, nPhases, ...
bgVal)
Description:
Batch function for ’CorrectSIMbleach’. Performs bleaching correction for all SIM acquisition files in the folder inPath that match the filename pattern fnPattern. Result
files are written to the folder outPath. Also creates a plot of the mean intensities of
the phase sum images before and after bleching correction and save it in the folder
outPath for quality control.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern; input files are named ’*fnPattern’
outPath <1xN char> path of output folder
funHndl of the function to process in batch mode
nChannels <1x1 uint> number of channels (different fluorophores)
nDirs <1x1 uint> number of grating directions (rotation angles)
nPhases <1x1 uint> nnumber of phase positions of the grating
bgVal <1x1 double> mean camera noise value or offset that is subtracted from
every pixel before bleaching estimation (similar to the ’removeFixedBgVal’
parameter in the .parR files for the SIM reconstruction algorithm).
if bgVal == -1: the actual value is calculated from the camera noise image
(first frame in the acquisition stack); otherwise the given value is used  
BatchCorrectSIMdrift
Syntax:
[] = BatchCorrectSIMdrift(inPath, fnPattern, outPath, acqRoot, pxSizeAcq, ...
pxSizeRecon, channels, refChannel)
Description:
Batch function for ’CorrectSIMdrift’. Performs drift correction for all SIM acquisition
files in the folder inPath that match the filename pattern fnPattern. Result files are
written to the folder outPath, together with a result summary and - in case of errors an error log file.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1x2 cell> containing 2 filename patterns as <1xN char> as follows:
fnPattern = {acqFile, reconFile} with pattern of acquisition named
acqFile files; input files are
’*acqFile’
reconFile pattern of reconstructed ’.mat’ files; input files are named
’*reconFile’
All patterns must include the file extension. It is expected that the
channel name defined in channels is included in the filename of the reconstructed ’.mat’ files, right before reconFile.
Example: Acquisitions are named ’01_SIM.kdf’, ’02_SIM.kdf’; channels are
’568’ and ’488’; reconstructions are named ’Slide1_#01_568_Results.mat’,
’Slide1_#01_488_Results.mat’, ’Slide1_#02_568_Results.mat’,
’Slide1_#02_488_Results.mat’ and so on
--> fnPattern = {’_SIM.kdf’, ’_Results.mat’} and channels = {’568’,’488’}
(as defined below)
outPath <1xN char> path of output folder
153
Anhang
acqRoot <1xN char> path of folder containing all subfolders with the acquisition
files (the images and their ’.log’ files)
pxSizeAcq <1x1 numerical> pixel size of SIM acquisition in nm
pxSizeRecon <1x1 numerical> pixel size of reconstructed images in nm
channels <1xN cell> containing the channel names as <1xN char> in their order of
acquisition
refChannel <1x1 uint> 1-based index of the reference channel. All other channels
belonging to the same acquisition are drift corrected relative to
refChannel  
BatchCreateResultFiles
Syntax:
[] = BatchCreateResultFiles(inPath, channels, outPath)
Description:
Batch function that first processes ’CreateResultFiles’ and subsequently
’WriteResultTiffs’, thereby scaling the intensities of the TIFF stacks with the factor
that scales the stack with the highest intensity to 255. Different channels of the
acquisitions are processed independently. Reads the reconstruction files (*.para.mat)
from the subfolders of inPath and writes the results to the target folder outPath,
using the source folder name as the fileID (beginning) of the target file name. The
following files are also written to outPath:
- ’CreateResultFiles_batch.log’ --> progress log
- ’channel_err.log’ --> errors log (1 file/channel)
- ’channel_intRange_Sum.csv’ --> intensity information of the Sum stacks
(1 file/channel)
- ’channel_intRange_Res.csv’ --> intensity information of the Result stacks
(1 file/channel)
Input:
inPath <1xN char> input folder containing the subfolders with the
’*.para.mat’ files
channels <1x1 cell> containing channel names (e.g. the laser lines) as <1xN char>.
Example: channels = {’568’, ’488’, ’404’}
outPath <1xN char> path of output folder 
Bildrekonstruktion 
CreateResultFiles
Syntax:
[] = CreateResultFiles(inPath, fnPattern, outPath, fileID)
Description:
Uses ’ReadParaFiles’ to read 3D-SIM reconstructions (’*para.mat’ files) into an array,
retrieves the Result and Sum image stacks and saves them to disk using
’WriteResultFiles’.
Batch processing: To process multiple folders, use ’BatchFoldersToFiles’ or
’BatchCreateResultFiles’ (the latter performs ’CreateResultFiles’ and subsequently
’WriteResultTiffs’).
Input:
inPath <1xN char> input folder containing the ’*para.mat’ reconstruction files
fnPattern <1xN char> filename pattern for ’ReadParaFiles’
outPath <1xN char> path of output folder
fileID <1xN char> file identifier for ’WriteResultFiles’  
GenerateParFiles
Syntax:
[] = GenerateParFiles(outPath, channel, zSteps, directions, phases, tmpParE, tmpParR)
154
Anhang
Description:
Generates .parE and .parR parameter files needed for SIM-reconstructions, using the
templates tmpParE and tmpParR:
- Fills in hard-coded values in ’tmpParE’ for the parameters ’lambdaEx’, ’lambda’ and
’gratingperiod’, depending on the laser line provided in channel, which can be ’568’,
’488’ or ’404’ at the moment - PLEASE ADJUST FOR YOUR EXPERIMENTAL SETUP! (Should be
read from adequate acquisition log files, someday)
- Fills in values for ’z_val’, ’directions’, ’phases’ and ’phase_val’, provided through
the input variables zSteps, directions, nPahses and phases.
- Saves the files ’channel.parE’ and channel.parR’ to the folder outPath.
Input:
outPath <1xN char> path of output folder
channel <1xN char> name of acquisition channel: currently restricted to ’568’,
’488’ or ’404’
zSteps <1x1 uint> number of object planes acquired in z-direction
directions <1xN numerical> grating rotations in ° (in order of acquisition)
phases <1xN numerical> phase positions of grating in ° (in order of acquisition)
tmpParE <1xN char> template for .parE file; read from ’tmp.parE’:
fread(fopen(’tmp.parE’), inf, ’*char’)’;
tmpParR <1xN char> template for .parR file; read from ’tmp.parR’:
fread(fopen(’tmp.parR’), inf, ’*char’)’;  
PrepareSIMrecon
Syntax:
[] = PrepareSIMrecon(inPath, fnPattern, outPath, channels, reconEXE, update)
Description:
Prepares 3D-SIM acquisitions matching the filename pattern ’*fnPattern’ in the folder
inPath for reconstruction:
- writes single-frame TIFF files for each acquired channel. The 1st image of the stack
(background) is skipped.
- write adjusted .parR and .parE files for each acquired channel, based on the templates ’tmp.parR’ and ’tmp.parE’
- writes the batch command file ’cmd.bat’, which automatically completes the reconstruction process for all prepared files
For each acquisition the ’.tif’, ’.parR’ and ’.parE’ files are saved in a separate subfolder within the folder outPath.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder with 3D-SIM acquisitions
fnPattern <1xN char> filename pattern of 3D-SIM stacks, incl. extension
Example: filenames ’01_SIM.kdf’, 02_SIM.kdf’ --> fnPattern = ’_SIM.kdf’
outPath <1xN char> path of output folder
channels <1x1 cell> containing channel names (e.g. the laser lines) as <1xN char>.
Example: channels = {’568’, ’488’, ’404’} --> TIFF files will be named
’568_000.tif’, ’568_001.tif’, ..., ’488_000.tif’, ’568_001.tif’ and so on.
reconEXE <1xN char> complete path and file name of SIM reconstruction application,
inc. ’.exe’
update Set to 1 to avoid rewriting of TIFF files (to update changes in ’tmp.parE’/
’tmp.parR’)  
ReadParaFiles
Syntax:
[paraStack] = ReadParaFiles(inPath, fileID)
Description:
Reads 3D-SIM reconstructions (’*para.mat’ files) into an array.
Input:
inPath <1xN char> input folder containing the ’*para.mat’ files
fileID <1xN char> filename definition of the para files of one channel:
’fileID__*_para.mat’ (e.g. laser line or label name)
155
Anhang
Output:
paraStack <1x1xN struct> structure array containing the parameters and result variables of all reconstruction files belonging to one channel of a 3D SIM
acquisition  
WriteResultFiles
Syntax:
[] = WriteResultFiles(resStack, sumStack, outPath, fileID)
Description:
Writes the Result and Sum stack from a SIM reconstruction into one MATLAB file with the
filename ’fileID_Results.mat’ in the folder outPath. Includes the min, max, mean and
sum intensities of both stacks in the variables ’intResStack’ and ’intSumStack’ and
also stores these values in the global variable ’resultFile’.
Batch processing: To process multiple folders, use ’BatchFoldersToFiles’ or
’BatchCreateResultFiles’ (the latter performs ’CreateResultFiles’ and subsequently
’WriteResultTiffs’).
Input:
resStack reconstructed Result image stack
sumStack Sum image stack
outPath <1xN char> path of output folder
fileID <1xN char> file identifier (beginning of output filename)  
WriteResultTiffs
Syntax:
[] = WriteResultTiffs(inPath, fnPattern, outPath, channel, maxIntRes, maxIntSum)
Description:
Creates Result and Sum image stacks from reconstructed SIM images in a MATLAB file
saved with the function ’CreateResultFiles’. The maximum intensities of the stacks are
scaled to maxIntRes and maxIntSum, respectively and saved as TIFF files in the folder
outPath.
Batch processing: To process multiple folders, use ’BatchFoldersToFiles’ or
’BatchCreateResultFiles’ (the latter performs ’CreateResultFiles’ and subsequently
’WriteResultTiffs’).
Input:
inPath <1xN char> input folder containing the MATLAB files saved with
’CreateResultFiles’
fnPattern <1xN char> filename pattern
outPath <1xN char> path of output folder
channel <1xN char> channel identifier (typically the laser line)
maxIntRes <1x1 numerical> maximum intensity for result stack scaling
maxIntSum <1x1 numerical> maximum intensity for sum stack scaling  
WriteResultTiffsIndividualScale
Syntax:
[] = WriteResultTiffsIndividualScale(inPath, fnPattern, outPath, channel)
Description:
Creates Result and Sum image stacks from reconstructed SIM images in a MATLAB file
saved with the function ’CreateResultFiles’. Negative values in the stacks are clipped,
the intensities are scaled to 0-255 and the results are saved as TIFF files in the
folder ’outPath\Res_0-255’ and ’outPath\Sum_0-255’.
Batch processing: Use ’BatchFoldersToFiles’ to process multiple folders.
156
Anhang
Input:
inPath <1xN char> input folder containing the MATLAB files saved with
’CreateResultFiles’
fnPattern <1xN char> filename pattern; input files are named ’*fnPattern.mat’
outPath <1xN char> path of output folder
channel <1xN char> channel identifier (typically the laser line) 
Bildkorrektur 
CorrectDirToDirBleaching
Syntax:
[res] = CorrectDirToDirBleaching(SIMimg, nChannels, nDirs, nPhases, bgVal)
Description:
Uses ’GetBleachingBtwDirs’ to determine bleaching factors during a SIM-acquisition and
corrects the bleaching between the corresponding Z-planes of different rotation angles
of the grating (does not correct for bleaching between different Z-planes! Use
’CorrectSIMbleach’ to include Z-plane-correction). Works only for acquisitions with
more than one grating direction. The fisrt image is the acquisition stack is expected
to show camera noise only.
Input:
SIMimg SIM acquisition OR <1xN char> complete path and filename
of a SIM acquisition stack
nChannels <1x1 uint> number of channels (different fluorophores)
nDirs <1x1 uint> number of grating directions (rotation angles)
nPhases <1x1 uint> nnumber of phase positions of the grating
bgVal <1x1 double> mean camera noise value or offset that is subtracted from
every pixel before bleaching estimation (similar to the ’removeFixedBgVal’
parameter in the .parR files for the SIM reconstruction algorithm).
if bgVal == -1: the actual value is calculated from the camera noise image
(first frame in the acquisition stack); otherwise the given value is used
Output:
res bleaching corrected SIM acquisition stack  
CorrectDriftBtwChannels
Syntax:
[resStacks, sumStacks, absShift] = CorrectDriftBtwChannels(SIMimg, reconFiles, ...
resFN, refChannel)
Description:
Corrects mechanical drifts in x and y direction during SIM acquisitions in the associated reconstructions (Sum and Result stacks). Uses ’GetDriftBtwDirs’ to determine the
drift for each channel in the acquisition stack. The reconstructed stacks for each
channel are aligned with the channel refChannel to compensate for drifts between the
channels, and resulting juts are cropped in all stacks.
Please note that drifts within the stacks of each channel are not corrected here - to
include z-plane-to-plane drift correction, use ’CorrectSIMdrift’ instead!
Input:
SIMimg <1xN char> complete path and filename of the raw SIM acquisition, incl.
file extension
reconFiles <1xN cell> containing the complete paths and filenames of the MATLAB
files with the reconstructions, incl. ’.mat’ extension as <1xN char>.
Provide the files in the order of acquisition and make sure there is a
reconstruction file for each acquired channel. All reconstructed stacks
must be of the same size.
resFN <1xN cell> containing the complete paths and filenames for the output
files of each channel, incl. ’.mat’ extension as <1xN char>. Provide
these in the order of acquisition
refChannel <1x1 uint> 1-based index defining the reference channel for stack
alignment (in acquisition order)
157
Anhang
Output:
resStacks drift corrected Result stacks; different channels are
concatenated along the 4th dimension (C) in acquisition order
sumStacks drift corrected Sum stacks; different channels are concatenated along the 4th dimension (C) in acquisition order
absShift shift in pixels found between the channels relative to
refChannel before correction (in acquisition order). absShift(:,1):
drift in x-direction, absShift(:,2): drift in y-direction  
CorrectSIMbleach
Syntax:
[res] = CorrectSIMbleach(SIMimg, nChannels, nDirs, nPhases, bgVal)
Description:
Uses ’GetBleachingBtwDirs’ to determine bleaching factors during a SIM-acquisition and
corrects the bleaching (use before reconstruction!).
First, a mean bleaching factor is calculated to correct plane-by-plane bleaching along
the Z-direction, then ’CorrectDirToDirBleaching’ is used to correct for remaining intensity fluctuations between the corresponding Z-planes of different grating rotations,
which can be caused by unequal illumination intensities (e.g. due to polarization
effects).
Works only for acquisitions with more than one grating direction. The fisrt image in
the acquisition stack is expected to show camera noise only.
Input:
SIMimg SIM acquisition OR <1xN char> complete path and filename
of a SIM acquisition stack
nChannels <1x1 uint> number of channels (different fluorophores)
nDirs <1x1 uint> number of grating directions (rotation angles)
nPhases <1x1 uint> nnumber of phase positions of the grating
bgVal <1x1 double> mean camera noise value or offset that is subtracted from
every pixel before bleaching estimation (similar to the ’removeFixedBgVal’
parameter in the .parR files for the SIM reconstruction algorithm).
if bgVal == -1: the actual value is calculated from the camera noise image
(first frame in the acquisition stack); otherwise the given value is used
Output:
res bleaching corrected SIM acquisition stack  
CorrectSIMdrift
Syntax:
[resStacks, sumStacks, chDrift] = CorrectSIMdrift(SIMimg, reconFiles, pxSizeAcq, ...
pxSizeRecon, resFN, refChannel)
Description:
Corrects mechanical drifts in x and y direction during SIM acquisitions in the associated reconstructions (Sum and Result stacks). Uses ’GetDriftBtwDirs’ to determine the
drift for each channel in the acquisition stack. The reconstructed stacks for each
channel are aligned with the channel refChannel to compensate for drifts beween the
channels, and resulting juts are cropped in all stacks. Drifts within the stacks of
each channel are corrected in a similar way. The drift corrected Sum and Result stacks
and the shifts found between channels before correction are saved as MATLAB files with
the paths resFN.
Batch processing: Use ’BatchCorrectSIMdrift’ to process multiple folders.
Input:
SIMimg <1xN char> complete path and filename of the raw SIM acquisition, incl.
file extension
reconFiles <1xN cell> containing the complete paths and filenames of the MATLAB
files with the reconstructions, including the ’.mat’ extension as
<1xN char>. Provide the files in the order of acquisition and make sure
there is a reconstruction file for each acquired channel. All reconstructed stacks must be of the same size.
pxSizeAcq <1x1 numerical> pixel size of SIM acquisition in nm
158
Anhang
pxSizeRecon <1x1 numerical> pixel size of reconstructed images in nm
resFN <1xN cell> containing the complete paths and filenames for the output
filesof each channel, incl. ’.mat’ extension as <1xN char>. Provide these
in the order of acquisition
refChannel <1x1 uint> 1-based index defining the reference channel for stack
alignment (in acquisition order)
Output:
resStacks drift corrected Result stacks; different channels are
concatenated along the 4th dimension (C) in acquisition order
sumStacks drift corrected Sum stacks; different channels are concatenated along the 4th dimension (C) in acquisition order
chDrift shift in pixels found between the channels relative to
refChannel before correction (in acquisition order). chDrift(:,1):
drift in x-direction, chDrift(:,2): drift in y-direction  
CreateDriftFig
Syntax:
[fHndl] = CreateDriftFig(drift)
Description:
Creates a compass plot showing the drift determined in a 3D-SIM acquisition stack with
3 channels (shown in red, green, blue) and 3 grating directions. The arrows show the
direction and length of the drift between grating rotation 1 and 2 (dashed lines) and 2
and 3 (solid lines) for the sharpest z-plane.
Annotation is fix at the moment - can be changed manually or included as input parameters someday...
Input:
drift dirft vectors determined with the function ’GetDriftBtwDirs’
or ’GetDriftBleachBtwDirs’
Output:
fHndl <1x1 double> handle of the result figure  
GetBleachingBtwDirs
Syntax:
[bleach] = GetBleachingBtwDirs(SIMimg, nChannels, nDirs, nPhases, bgVal)
Description:
Determines bleaching factors during SIM-acquisition based on comparison of the Sum images over the phase shifts belonging to the same z-plane (but a different rotation angle
of the grating). Works only for acquisitions with more than one grating direction.
Input:
SIMimg SIM acquisition OR <1xN char> complete path and filename
of a SIM acquisition stack
nChannels <1x1 uint> number of channels (different fluorophores)
nDirs <1x1 uint> number of grating directions (rotation angles)
nPhases <1x1 uint> nnumber of phase positions of the grating
bgVal <1x1 numerical> mean camera noise value or offset that is subtracted from
every pixel before bleaching estimation (similar to the ’removeFixedBgVal’
parameter in the ’.parR’ files for the SIM reconstruction algorithm)
Output:
bleach bleaching factors (remaining
intensity in the same z-plane of the next grating direction) for each
channel (1st dimension), each successive grating direction (2nd dimension)
and each z-plane. The factors in bleach(:,:,:,1) are calculated based on
the maximum intensities in the whole z-plane and the factors in
bleach(:,:,:,2) are based on the sum of all intensities in the z-plane
minus bgVal --> sum(intensities-bgVal) 
159
Anhang
 
GetDriftBleachBtwDirs
Syntax:
[drift, bleach] = GetDriftBleachBtwDirs(SIMimg, nChannels, nDirs, nPhases, bgVal)
Description:
Determines drift and bleaching during SIM-acquisition based on comparison of the Sum
images over the phase shifts belonging to the same z-plane (but a different rotation
angle of the grating). Works only for acquisitions with more than one grating direction.
Input:
SIMimg SIM acquisition OR <1xN char> complete path and filename
of a SIM acquisition stack
nChannels <1x1 uint> number of channels (different fluorophores)
nDirs <1x1 uint> number of grating directions (rotation angles)
nPhases <1x1 uint> nnumber of phase positions of the grating
bgVal <1x1 numerical> mean camera noise value or offset that is subtracted from
every pixel before bleaching estimation (similar to the ’removeFixedBgVal’
parameter in the .parR files for the SIM reconstruction algorithm)
Output:
drift drift in x (== drift(:,:,1)) and y
(== drift(:,:,2)) direction of the sharpest z-plane of the stack for each
channel (1st dimension) and each successive grating direction
bleach bleaching factors (remaining
intensity in the same z-plane of the next grating direction) for each
channel (1st dimension), each successive grating direction (2nd dimension)
and each z-plane. The factors in bleach(:,:,:,1) are calculated based on
the maximum intensities in the whole z-plane and the factors in
bleach(:,:,:,2) are based on the sum of all intensities in the z-plane
minus bgVal --> sum(intensities-bgVal)  
GetDriftBtwDirs
Syntax:
[drift] = GetDriftBtwDirs(SIMimg, nChannels, nDirs, nPhases)
Description:
Determines mechanical drifts during SIM-acquisition based on comparison of the Sum images over the phase shifts belonging to the same z-plane (but a different rotation angle
of the grating). Works only for acquisitions with more than one grating direction.
Input:
SIMimg SIM acquisition OR <1xN char> complete path and filename
of a SIM acquisition stack
nChannels <1x1 uint> number of channels (different fluorophores)
nDirs <1x1 uint> number of grating directions (rotation angles)
nPhases <1x1 uint> nnumber of phase positions of the grating
Output:
drift drift in x (==drift(:,:,1)) and y
(== drift(:,:,2)) direction of the sharpest z-plane of the SIM stack for
each channel (1st dimension) and each successive grating direction 
Bildanalyse 
CollectIntInfoSIMacq
Syntax:
[res] = CollectIntInfoSIMacq(inPath, fnPattern, outPath, channels)
160
Anhang
Description:
Collects intensity information from the sum images of all SIM-acqisitions (the raw
stacks, not the reconstructions) that match the filename pattern ’*fnPattern’ in the
folder inPath. Each channel within the acquisition stack is analyzed separately. Returns the gathered information as a cell array (see Output for details) and optionally
writes it to the the comma-separated text files ’SIMacqSumIntInfo_channels.txt’.
Batch processing: Use ’BatchMeasure’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern, incl. extension; input files are named
’*fnPattern’
outPath <1xN char> path of output folder OR 0 if no result file should be written
channels <1x1 cell> containing channel names as <1xN char>
Output:
res <8xN cell> containing the following information for N image files:
info{1} <1x1 cell> containing sample identifiers as <1xN char>
info{2} <1x1 double> minimal intensity (darkest pixel)
info{3} <1x1 double> mean intensity
info{4} <1x1 double> maximal intensity (brightest pixel)
info{5} <1x1 double> sum of all intensities
info{6} <1x1 double> mean background intensity (calculated from the first
image plane, which has to be a camera noise image)
info{7} <1x1 double> number of pixels
info{8} <1x1 double> background corrected intensity sum 
A.1.4. Funktionen für SPDM-Aufnahmen
Batchfunktionen 
BatchEvaluateFoci
Syntax:
[] = BatchEvaluateFoci(inPath, fnPattern, outPath)
Description:
Batch function for ’EvaluateFoci’. Calls ’EvaluateFoci’ for all Orte matrix files in
the folder inPath, and...
- appends the results (see ’EvaluateFoci’ documentation) as new variables to the corresponding MATLAB file with the Orte matrix
- summarizes the results in a comprehensive table that is saved to the file
’outPath\fociEvaluation.txt’, using ’SaveMeasurements’
- combines the next neighbor distances of all processed files (keeping ’foci’ signals
and ’rest’ separate) and saves them as a table to the comma-separated text file
’outPath\nn4Dict.txt’.
- combines the mean distances to the next 4 neighbors of all processed files (keeping
’foci’ signals and ’rest’ separate) and saves them as a table to the comma-separated
textfile ’outPath\nnDict.txt’.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern of Orte matrix files, incl. ’.mat’; input
files are named ’*fnPattern’
outPath <1xN char> path of output folder  
OrteDriftCorrection
Syntax:
[] = OrteDriftCorrection(inPath, fnPattern, outPath, acqRoot, pxSize)
Description:
Corrects the mechanical drift during SPDM aqcuisition for all Orte matrices saved in
161
Anhang
the specified folder. Executes the function ’CorrectDriftOrte’ to perform the actual
correction.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1x4 cell> containing 4 filename patterns as <1xN char> as follows:
fnPattern = {orteFile, img0, img1, SPDMimgLog}
orteFile pattern of Orte matrix MATLAB file
img0 pattern of correction image acquired before the SPDM aqcuisition
img1 pattern of correction image acquired after the SPDM acquisition
SPDMimgLog pattern of SPDM acquisition log file
All patterns must include the file extension. Example:
fnPattern = {’_orte.mat’, ’_DAPI_before_SPDM.kdf’, ...
’_DAPI_after_SPDM.kdf’, ’_SPDM.log’}
acqRoot <1xN char> path of folder containing all subfolders with the acquisition
files (image stacks and their ’.log’ files) the Orte matrices derive from.
The folder structure must match to the filename of the Orte matrix file.
Example: Orte file ’1h_#01_orte.mat’ --> ’folder_#acqNo_...’. Path of
matching acquisition files: ’acqRoot\folder\’, or in this example
’acqRoot\1h\’, and the acquisition files are named ’acqNofnPattern{2...4}’
with fnPattern as described above (log file in this example:
’acqRoot\1h\01_SPDM.log’)
outPath <1xN char> path of output folder
pxSize <1x1 numerical> pixel size of SPDM acquisition in nm  
SPDMdriftCorrection
Syntax:
[] = SPDMdriftCorrection(inPath, fnPattern, outPath, varargin)
Description:
Corrects the mechanical drift during SPDM aqcuisition for all files specified by
fnPattern in the folder inPath and writes the shift corrected acquisition stack to
the folder outPath. Executes the function ’CorrectDriftSPDM’ to perform the actual
correction.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1x3 cell> containing 3 filename patterns as <1xN char> as
follows: fnPattern = {img0, img1, SPDMimg} with pattern of correction image
img0 acquired before the SPDM acquisition
img1 pattern of correction image acquired after the SPDM acquisition
SPDMimg pattern of SPDM acquisition
All patterns must include the file extension.
Example: fnPattern = {’_DAPI_before_SPDM.kdf’, ’_DAPI_after_SPDM.kdf’, ...
’_SPDM.kdf’}
outPath <1xN char> path of output folder for result files
varargin <1xN cell> optional parameter for ’CorrectDriftSPDM’ to set SPDM integration time in seconds, rather than reading it from the log file
’SPDMimg.log’ 
Bildkorrektur 
CorrectDriftOrte
Syntax:
[res] = CorrectDriftOrte(t0img, t1img, SPDMintTime, orteFile, pxSize, outPath)
Description:
Corrects Orte matrix for mechanical drift during SPDM acquisition, which is assumed to
be linear. The drift vector is calculated based on two 2D images acquired immediately
before (t0img) and after (t1img) SPDM acquisition. Samples must have an additional
staining with a fluorophore that will not be detected (nor bleached out) under the SPDM
162
Anhang
conditions, e.g. DAPI to acquire the correction images.
Supports KDF (Khoros Data Format) and various other image formats (TIFF, BMP, JPG, GIF,
PNG, ...); see documentation of MATLAB’s ’imread’ fuction for further details.
RGB images are supported, but will be converted to grayscale for shift determination.
Other color models like CMYK should not be used, as they might not be converted to
grayscale correctly (mean of all samples/pixel is used for grayscale conversion).
Mixing formats is possible but not recommended, as differences in bitdepth can lead to
inaccuracies.
Input:
t0img <1xN char> complete path and filename of first image (t0)
t1img <1xN char> complete path and filename of second image (t1)
SPDMintTime <1x1 numerical> integration time of SPDM acquisition in seconds OR
<1xN char> complete path and filename of SPDM acquisition log file containing the integration time
orteFile <1xN char> complete path and filename of the Orte matrix
pxSize <1x1 numerical> pixel size of SPDM acquisition in nm
outPath 0 OR <1xN char> (see below)
Output:
res if outPath == 0: returns the drift corrected Orte matrix
if outPath is a valid folder path of type <1xN char>: writes the
following files to the folder outPath and to subfolders of outPath and
returns 1 if successful, or 0 otherwise:
- drift corrected Orte matrix plus additional info incl. localization
images and histograms of next neighbor distances (see ’SaveSPDMres’)
--> ’outPath\SPDM_filename_driftCorr.mat’
- t0/t1 overlay images before and after drift correction (to check drift
correction accuracy) --> ’outPath\SPDM_filename_driftCorrCheck.tif’  
CorrectDriftSPDM
Syntax:
[res] = CorrectDriftSPDM(t0img, t1img, SPDMimg, outPath, varargin)
Description:
Corrects SPDM images for mechanical drift during acquisition, which is assumed to be
linear. The drift vector is calculated based on the 2D images t0img and t1img acquired
immediately before and after SPDM acquisition. Samples must have an additional staining
with a fluorophore that will not be detected (nor bleached out) under the SPDM conditions, e.g. DAPI to acquire the correction images.
Supports KDF (Khoros Data Format) and various other image formats (TIFF, BMP, JPG, GIF,
PNG, ...); see documentation of MATLAB’s ’imread’ fuction for further details. RGB
images are supported, but will be converted to grayscale for shift determination. Other
color models like CMYK should not be used, as they might not be converted to grayscale
correctly (mean of all samples/pixel is used for grayscale conversion). Mixing formats
is possible but not recommended, as differences in bitdepths can lead to inaccuracies.
Input:
t0img <1xN char> complete path and filename of first image (t0)
t1img <1xN char> complete path and filename of second image (t1)
SPDMimg <1xN char> complete path and filename of SPDM acquisition
outPath 0 OR <1xN char> (see below)
varargin <1x1 numerical> (optional); can be used to set SPDM integration time in
seconds, rather than reading it from the log file ’SPDMimg.log’
Output:
res if outPath == 0: returns the drift corrected SPDM image stack as

if outPath is a valid folder path of type <1xN char>: writes the drift
corrected SPDM image stack to the file
’outPath\SPDM_filename_driftCorr.kdf’. Additionally writes
’outPath\SPDM_filename_driftCorrCheck.tif’, which contains a t0/t1
overlay image before and after drift correction for easy visual control
of correct drift determination. Returns 1 if successful, or 0 otherwise 
163
Anhang
 
Fast_MFP
Syntax:
[] = Fast_MFP(orteFile, outPath)
Description:
Loads Orte matrix from a given file and passes it to ’fast_multiframepoints’. Results
are passed to the function ’saveSPDMres’ to save the new Orte matrix, together with
additional information.
Batch processing: Use ’BatchFilesInFolder’ to process multiple files (can be combined
with ’BatchFolders’ to process multiple folders).
Input:
orteFile <1xN char> complete path and filename of the MATLAB file
containing the Orte matrix, incl. ’.mat’ extension
outPath <1xN char> path of output folder  
FilterOrte
Syntax:
[res] = FilterOrte(SPDMimg, pxSizeAcq, Orte, pxSizeRes, locErrTH, intTH, ...
locErrLowPass, intLowPass, outPath)
Description:
Filters an Orte matrix based on localization error and the absolute intensity of the
signals within the SPDM acquisition stack. Saves the filtered Orte matrix with extra
information and images.
Input:
SPDMimg <1xN char> complete path and filename of SPDM acquisition
pxSizeAcq <1x1 numerical> pixel size of SPDM acquisition in nm
Orte the Orte matrix
pxSizeRes <1x1 numerical> pixel size for images to generate from the filtered
Orte matrix
locErrTH <1xN double> localization error threshold in nm
intTH <1xN uint> intensity threshold in acquisition stack
locErrLowPass <1x1 logical> true means entries with smaller localization errors than
locErrTH survive
intLowPass <1x1 logical> true means entries with lower intensities than intTH
survive
outPath <1xN char> path of output folder
Output:
res the filtered Orte matrix  
FilterOrteCol
Syntax:
[res] = FilterOrteCol(Orte, col, TH, lowPass)
Description:
Filters an Orte matrix based on a particular column
Input:
Orte the Orte matrix
Col <1x1 uint> the filter column
TH <1x1 numerical> threshold value
lowPass <1x1 logical> true means lower values than TH survive
Output:
res filtered Orte matrix 
164
Anhang
Bildanalyse 
CombineNNDist
Syntax:
[nn, nn4, nn8] = CombineNNDist(inPath, fnPattern, outPath)
Description:
Collects neighbor distance information in all Orte matrices specified by the filename
pattern fnPattern in the folder inPath and combines it to get the typical distance
profiles of replicate SPDM acquisitions. Results are returned and optionally saved as
’fnPattern_NNDist.mat’ in the folder outPath.
Batch processing: Use ’BatchFolders’ to process multiple folders.
Input:
inPath <1xN char> path of input folder
fnPattern <1xN char> filename pattern; input files are named ’fnPattern*.mat’
outPath <1xN char> path of output folder OR 0 if no result file should be saved
Output:
nn next neighbor distances
nn4 mean distances to the next 4 neighbors
nn8 mean distances to the next 8 neighbors  
EvaluateFoci
Syntax:
[foci, fociStats, rest, fociMaskImg] = EvaluateFoci(Orte)
Description:
Uses ’Region’ (by Manuel Gunkel) to search for foci (large clusters) within an Orte matrix and determines and returns various features for individual foci, all foci together
and the rest of the signals outside of the foci (see Output for details). Also returns
a localization image (white) overlaid with the mask that defines the individual foci
(green).
Input:
Orte <1xN double> the Orte matrix
Output:
foci <1xN struct> with the following fields for each focus:
count <1x1 double> number of signals
Orte Orte matrix containing only the signals within
the focus. In column 13 to 15 the distances to the next
neighbor and the mean distances to the next 4 and next 8
neighbors are added/updated
centerOfMass <1x2 double> center of mass, where centerOfMass(1,1) is the
x-position and centerOfMass(1,2) is the y-position in nm
area <1x1 double> focus area in nm^2
density <1x1 double> focus density in singals/nm^2
fociStats <1x1 struct> with the following fields for all foci joint:
centerOfMass <1x2 double> center of mass, where centerOfMass(1,1) is
the x-position and centerOfMass(1,2) is the y-position
in nm
nnDist next neighbor distances in nm
meanNNDist <1x1 double> mean distance to the next neighbor in nm
meanSignalCount <1x1 double> mean number of signals/focus
stdSignalCount <1x1 double> standard deviation from the mean of the
signal counts/focus
meanArea <1x1> double> mean focus area in nm^2
stdArea <1x1> double> standard deviation from the mean of the
focus areas in nm^2
meanDensity <1x1> double> mean focus density in signals/nm^2
stdDensity <1x1> double> standard deviation from the mean of the
focus density in signals/nm^2
165
Anhang
rest <1xN struct> with the following fields for signals outside of the foci:
count <1x1 double> number of signals
Orte Orte matrix containing only the signals outside
of the foci. In column 13 to 15 the distances to the next
neighbor and the mean distances to the next 4 and next 8
neighbors are added/updated
meanNNDist <1x1 double> mean distance to the next neighbor in nm
fociMaskImg <3x1 dip_image_array> overlay image showing the localized signals as
white pixels and the foci mask as green areas. The pixel size is equal to
the mean localization error in Orte (x and y errors averaged).  
getOrteInfo
Syntax:
[d, nLoc, meanLocErr] = getOrteInfo(Orte, pxSizeRes)
Description:
Shows info about an Orte matrix: number of signals, a histogram showing the x-yaveraged localization errors, the mean of all localization errors and a localization
image generated with ’fastOrte2cuStdBild’, using a pixel size of pxSizeRes.
Input:
Orte the Orte matrix
pxSizeRes <1x1 numerical> pixel size in nm
Output:
d localization image
nLoc <1x1 double> number of signals in Orte
meanLocErr <1x1 double> mean of all localization errors  
OrteFromImgMask
Syntax:
[innerOrte, selection] = OrteFromImgMask(Orte, mask, pxSize)
Description:
Filters an Orte matrix based on an image mask that represents a selection on a localization image generated from the Orte matrix using ’Orte2PunktBild’ (use ’roipoly’ to
manually draw a selection mask)
Input:
Orte the Orte matrix
mask binary mask
pxSize <1x1 numerical> pixel size in nm used to generate the ’Orte2PunktBild’
Output:
innerOrte filtered Orte matrix containing only the
selected entries
selection binary mask of selected entries in Orte  
SaveSPDMres
Syntax:
[] = SaveSPDMres(orteFile, outPath, varargin)
Description:
Adds the following info to the orte matrix file orteFile and saves it to the folder
outPath:
meanLocErr <1x1 numerical> mean xy localization accuracy (added as new variable)
gaussBild localization image generated with ’fastOrte2gaussBild’ (all
events are blurred with gaussian blur using the mean localization error)
(added as new variable)
stdBild localization image generated with ’fastOrte2cuStdBild’ (events
are blurred using their individual localization error) (added as new
variable)
166
Anhang
NNDist distance to the next neighbor of each event (added in column
13 of the Orte matrix)
NN4Dist mean distance to the next 4 neighbors of each event (added in
column 14 of the Orte matrix)
NN8Dist mean distance to the next 8 neighbors of each event (added in
column 15 of the Orte matrix)
Additionally, the following images are saved to the indicated folders, which are generated as subfolders of outPath:
- gaussBild --> TIFF file in folder ’Orte2gaussBild’
- stdBild --> TIFF file in folder ’Orte2cuStdBild’
- Histogram of NNDist --> EMF file in folder ’NNDist’
- Histogram of NN8Dist --> EMF file in folder ’NN8Dist’
Input:
orteFile <1xN char> complete path and filename of Orte matrix file, incl. ’.mat’
outPath <1xN char> path of output folder
varargin <1xN cell> (optional): varargin = {Orte, pxSizeRes, std}
Orte Orte matrix
pxSizeRes <1x1 numerical> final pixel size for generation of localization
images (stdBild and gaussBild); default is 20
std <1x1 numerical> standard deviation of 2D gaussian used for
blurring to generate the image gaussBild; default is the xymean localization error as calculated from the Orte matrix 
Visualisierung 
Orte2SymbolMap
Syntax:
[res] = Orte2SymbolMap(Orte, pxSizeRes, symbol)
Description:
Plots the points within the Orte matrix Orte as symbols into the image res, using a
pixel size of pxSizeRes nm.
Input:
Orte the Orte matrix
pxSizeRes <1x1 numerical> pixel size in nm
symbol defines the marker symbol: either ’x’, ’+’, ’o’, ’.’, ’d’ (for diamond),
’r’ (for rectangle), pairs of these (e.g. ’o.’ or ’.o’ draws open circles
with a dot in the center), or a 5x5 single custom pixel map
Output:
res binary result image (0 or 255)  
ShowLocEventsCL
Syntax:
res = ShowLocEventsCL(SPDMimg, pxSizeAcq, Orte, varargin)
Description:
Marks the signal positions in an Orte matrix as red pixels in the corresponding SPDM
acquisition stack. Optionally color codes signals from different clusters if a cluster
mask image and its pixel size is provided.
Input:
SPDMimg <1xN char> complete path and filename of acquisition stack OR the stack
itself as
pxSizeAcq <1x1 numerical> pixel size of SPDM acquisition in nm
Orte Orte matrix
167
Anhang
varargin <1x2 cell> (optional):
varargin = {clusterMask, pxSizeCl}
clusterMask cluster mask image where different clusters are
labeled by differnt intensity (pixels of the same cluster
have the same intensity)
pxSizeCl <1x1 double> pixel size of cluesterMask in nm
Output:
res <3x1 dip_image_array> SPDM acquisition stack with marked Orte positions 
A.1.5. Funktionen zur Kombination von SIM- und SPDM-Aufnahmen 
BatchSaveOrteSIM
Syntax:
[] = BatchSaveOrteSIM(dataSheet, SIMpath, SPDMpath, outPath)
Description:
Saves an Orte matrix and its matching plane in a 3D-SIM image into one MATLAB file in
the folder SPDMpath. Reads the filenames of the input MATLAB files are read from an
Excel data sheet based on the template ’Acquisition_log.xltx’.
Input:
dataSheet <1xN char> complete path and filename of the Excel file
SIMpath <1xN char> path of the folder containing the MATLAB files with the SIMreconstructions. Please note that this function extracts the z-plane from
the 3D-SIM stack that matches the plane of the SPDM-acquisition without
taking drift between the acquisitions into account - use ’CombineSIMspdm’
to get the exact plane with subpixel accuracy
SPDMpath <1xN char> path of the folder containing the MATLAB files
with the Orte matrices
outPath <1xN char> path of output folder  
CombineSIMspdm
Syntax:
[] = CombineSIMspdm(simResultFile, Orte, triImg, fileID, SIMplanes, SPDMpxSize, ...
SIMpxSize, outPath)
Description:
Combines localization images and their matching planes in the Result and Sum stack of a
3D-SIM reconstruction. Uses the functions ’MatchImgSizes’ and ’CorrectShiftMatchZ’ to
align the images and saves the following images into the folder outPath as TIFF files
and additionally as variables in the MATLAB file ’fileID_SIMspdm.mat’:
- ’resTri’: triangulation image, shifted and cropped to match ’resResImg’
- ’resResImg’: size adjusted interpolated plane from resStack that matches the triangulation image after shifting
- ’combResTri’: combination of ’resTri’ (gray) and ’resResImg’ (red)
- ’resSumImg’: size adjusted interpolated plane from sumStack that matches the triangulation image after shifting
- ’combSumTri’: combination of ’resTri’ (gray) and ’resSumImg’ (red)
- ’OrtePunktBild’: point representation of localized SPDM events, shifted and cropped
to match ’resResImg’
- ’combResOrte’: combination of ’OrtePunktBild’ (gray) and ’resResImg’ (red)
Input:
simResultFile <1xN char> complete path and filename of a SIM result file created with
’WriteResultFiles’, incl. ’.mat’ (MATLAB file containing the variables
’resStack’ and ’sumStack’)
Orte Orte matrix OR <1xN char> complete path and filename of
Orte matrix file, incl. ’.mat’
triImg triangulation image generated from the Orte matrix OR
<1xN char> complete path and filename of the triangulation image file,
incl. extension (several formats are supported, see ’imread’ documentation). The ’LMVis’ tool by David Baddeley can be used to generate tri168
Anhang
angulation images
fileID <1xN char> output file identifier (beginning of the filenames)
SIMplanes <1xN uint> can be used to specify a subset of planes in the SIM images
to accelerate z-matching with localization images. Set 0 to include the
whole stacks
SPDMpxSize <1x1 double> pixel size of triangulation image in nm (will be used for
generation of result images)
SIMpxSize <1x1 double> pixel size of SIM images in nm
outPath <1xN char> path of output folder 
A.2. Fits der DSB-Reparaturkinetik in Abschnitt 4.2.1
Zur Charakterisierung der DSB-Reparaturkinetik anhand des γH2AX-Signals wurden die Ergebnisse der FACS-Messungen zwischen 0 und 4 h nach Bestrahlung mit Photonen oder 12CIonen verwendet um mit Hilfe der MATLAB Curve Fitting Toolbox Fitfunktionen gemäß Gleichung (A.1) zu berechnen.
i(t) =
p1t2 + p2t
t2 +q1t +q2
| t ≥ 0, p1 < 0, p2,q1,q2 > 0 i Intensität
t Zeit
p1, p2,q1,q2 Konstanten
(A.1)
Aus den Fits wurden mit Hilfe der MATLAB-Funktion AnalyzeDSBrepairKinetics einige
für die Reparaturkinetik charakteristische Kenngrößen bestimmt: 
AnalyzeDSBrepairKinetics
Syntax:
[res] = AnalyzeDSBrepairKinetics(varargin)
Description:
Calculates characteristic values that describe the kinetics of DNA repair after
ionizing radiation as measured by FACS analysis of a DSB marker. The function
’i(t) = (p1*t^2+p2*t)/(t^2+q2*t+q3) | t>0, p1<0, p2,q1,q2>0’ is used to fit experimental data representing fluorescence intensities i at different time points t (should
include an unirradiated control sample for t=0. Intensity should be background corrected by subtracting the level of the control sample).
Input:
varargin <1x1 cell> containing a object created with the Curve Fitting
Toolbox (’cftools’) using the given fit function OR <2x1 cell> containing
the raw time lapse data:
varargin{1} timepoints t
varargin{2} Intensities i
varargin{1} and varargin{2} must be paired and must have the same size
Output:
res <1x1 struct> with the following fields (values calculated based on determined fit function):
tMAX <1x1 double> time point of maximum intensity
t50 <1x1 double> time point of half maximum intensity within
repair phase (after tMAX)
dtMAX50 <1x1 double> half-value period (period between tMAX and t50
iMAX <1x1 double> maximum intensity reached
mVrepA <1x1 double> mean absolute repair velocity between tMAX and
t50as delta i/time unit
mVrepR <1x1 double> mean repair velocity between tMAX and t50
relative to iMAX as percent/time unit 
169
Anhang
Die Funktionsgleichungen der Fits und ihr Bestimmtheitsgrad (Ausgaben der Curve Fitting
Toolbox), sowie die abgeleiteten Kenngrößen sind nachfolgend aufgeführt.
1 Gy Zeitreihen
Alle Zellen 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -8990 -82,09
p2 5,03e+04 401,3
q2 46,16 0,0868
q3 31,12 0,3907
Bestimmtheitsgrad:
SSE 507,1 106,5
R2 0,9974 0,9982
Adj. R2 0,9935 0,9956
RMSE 15,92 7,298
Kenngrößen:
tMAX (h) 1,3290 0,5460
t50 (h) 3,8473 1,6755
dtMAX50 (h) 2,5183 1,1295
iMAX 540,8930 264,3798
mVrepA (di/h) 107,3920 117,0375
mVrepR (%/h) 19,85 44,27
G1 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -1,25e+04 -253,8
p2 7,08e+04 1295
q2 49,68 2,041
q3 39,68 0,7903
Bestimmtheitsgrad:
SSE 989,6 1,955
R2 0,9966 1
Adj. R2 0,9916 0,9999
RMSE 22,24 0,9886
Kenngrößen:
tMAX (h) 1,4233 0,6488
t50 (h) 3,9600 2,3896
dtMAX50 (h) 2,5367 1,7408
iMAX 671,3690 289,2329
mVrepA (di/h) 132,3314 83,0751
mVrepR (%/h) 19,71 28,72
S 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -1,43e+04 -52,87
p2 9,18e+04 191
q2 130,2 1,81e-08
q3 79,33 0,2431
Bestimmtheitsgrad:
SSE 256,5 1065
R2 0,9973 0,9632
Adj. R2 0,9932 0,9081
RMSE 11,33 23,07
Kenngrößen:
tMAX (h) 1,4344 0,4303
t50 (h) 4,3791 1,2726
dtMAX50 (h) 2,9447 0,8423
iMAX 381,3758 169,0419
mVrepA (di/h) 64,7564 100,3476
mVrepR (%/h) 16,98 59,36
G2 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -342,5 -59,05
p2 1973 238,8
q2 2,115 2,29e-09
q3 1,183 0,2438
Bestimmtheitsgrad:
SSE 174,7 2562
R2 0,9985 0,944
Adj. R2 0,9962 0,9066
RMSE 9,346 29,22
Kenngrößen:
tMAX (h) 0,7921 0,4371
t50 (h) 2,7645 1,3185
dtMAX50 (h) 1,9724 0,8814
iMAX 386,5912 214,0820
mVrepA (di/h) 98,0024 121,4452
mVrepR (%/h) 25,35 56,73
M 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -632,2 -642,5
p2 1491 1286
q2 1,68e-11 2,76e-09
q3 0,9737 0,5705
Bestimmtheitsgrad:
SSE 1067 2,83e+04
R2 0,9973 0,9553
Adj. R2 0,9955 0,9255
RMSE 18,86 97,09
Kenngrößen:
tMAX (h) 0,6569 0,5223
t50 (h) 1,5033 1,2266
dtMAX50 (h) 0,8464 0,7043
iMAX 503,0040 588,6395
mVrepA (di/h) 297,1363 417,8896
mVrepR (%/h) 59,07 70,99
170
Anhang
4 Gy Zeitreihen
Alle Zellen 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 3208- 1917-
p2 2,56e+04 1,11e+04
q2 10,61 7,599
q3 3,167 1,23
Bestimmtheitsgrad:
SSE 2509 847,1
R2 0,9984 0,9989
Adj. R2 0,996 0,9972
RMSE 35,42 20,58
Kenngrößen:
tMAX (h) 1,0074 0,6429
t50 (h) 4,2825 2,9976
dtMAX50 (h) 3,2751 2,3547
iMAX 1,51e+03 970,2752
mVrepA (di/h) 231,0068 206,0284
mVrepR (%/h) 15,27 21,23
G1 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -8,97e+06 -1,74e+06
p2 6,39e+07 9,72e+06
q2 2,24e+04 6482
q3 8046 1003
Bestimmtheitsgrad:
SSE 7431 3427
R2 0,9967 0,9962
Adj. R2 0,9916 0,9905
RMSE 60,95 41,4
Kenngrößen:
tMAX (h) 1,2801 0,7871
t50 (h) 4,6675 3,4894
dtMAX50 (h) 3,3874 2,7023
iMAX 1,83e+03 1,08e+03
mVrepA (di/h) 269,7447 199,0891
mVrepR (%/h) 14,76 18,50
S 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -14,84 -457,3
p2 2354 3302
q2 0,6673 2,775
q3 0,5011 0,4001
Bestimmtheitsgrad:
SSE 258,9 349,4
R2 0,9997 0,9992
Adj. R2 0,9992 0,9981
RMSE 11,38 13,22
Kenngrößen:
tMAX (h) 0,7033 0,4990
t50 (h) 3,2781 2,6344
dtMAX50 (h) 2,5749 2,1354
iMAX 1,13e+03 754,0863
mVrepA (di/h) 218,4621 176,5714
mVrepR (%/h) 19,42 23,42
G2 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -73,31 -749,5
p2 2804 4326
q2 0,8168 3,062
q3 0,4667 0,4703
Bestimmtheitsgrad:
SSE 609,3 1409
R2 0,9994 0,9979
Adj. R2 0,9986 0,9947
RMSE 17,45 26,54
Kenngrößen:
tMAX (h) 0,6641 0,5037
t50 (h) 3,1158 2,4387
dtMAX50 (h) 2,4517 1,9350
iMAX 1,26e+03 877,6220
mVrepA (di/h) 257,3331 226,7754
mVrepR (%/h) 20,39 25,84
M 12C-Ionen Photonen
Koeffizienten:
p1 -24,15 -0,0002
p2 1,40e+04 1,05e+04
q2 5,477 4,325
q3 0,4138 1,024
Bestimmtheitsgrad:
SSE 1,18e+04 2,63e+04
R2 0,9962 0,9862
Adj. R2 0,9904 0,9655
RMSE 76,94 114,6
Kenngrößen:
tMAX (h) 0,6396 1,0119
t50 (h) 7,8287 8,2480
dtMAX50 (h) 7,1892 7,2362
iMAX 2,06e+03 1,66e+03
mVrepA (di/h) 143,5378 114,4984
mVrepR (%/h) 6,95 6,91
171
Anhang
A.3. Analyse der Signaldistanzen in den SPDM-Daten aus Abschnitt
4.3.2 im Vergleich zu Zufallsverteilungen
Abbildung A.1. | γH2AX-Signale in SPDM-Daten im Vergleich zu Zufallsverteilungen. Oben: Histogramm aller Distanzen zwischen den Signalen. Unten: Mittlere Distanzen zu den 4 nächsten Nachbarn. Die Histogramme repräsentieren je eine Messreihe aus allen SPDM-Aufnahmen aus Abschnitt
4.3.2 (blau) und allen entsprechenden Zufallsverteilungen (cyan).
172
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